• facebook
  • linkedin
  • YouTube

Disa shpikje revolucionare në historinë e teknologjisë së zbulimit në mendjen time janë teknologjia e etiketimit të imunitetit të bazuar në parimin e lidhjes specifike antigjen-antitrup, teknologjinë PCR dhe teknologjinë e sekuencës.Sot do të flasim për teknologjinë PCR.Sipas evolucionit të teknologjisë PCR, njerëzit zakonisht e ndajnë teknologjinë PCR në tre gjenerata: teknologji e zakonshme PCR, teknologji sasiore fluoreshente PCR në kohë reale dhe teknologji dixhitale PCR.

Cteknikë e zakonshme PCR

w1

KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)

Kary Mullis shpiku reaksionin zinxhir të polimerazës (reaksion zinxhir polimerazë, PCR) në vitin 1983. Thuhet se kur po ngiste të dashurën e tij, papritmas pati një ndezje frymëzimi dhe mendoi për parimin e PCR (mbi përfitimet e ngasjes).Kary Mullis u nderua me Çmimin Nobel në Kimi në vitin 1993. New York Times komentoi: "Shumë origjinale dhe domethënëse, pothuajse duke e ndarë biologjinë në epokat para PCR dhe pas PCR.

Parimi i PCR: Nën katalizimin e polimerazës së ADN-së, ADN-ja e vargut amë përdoret si shabllon, dhe primeri specifik përdoret si pikënisje e shtrirjes, dhe ADN-ja e vargut bijë, plotësuese e ADN-së së shabllonit të vargut amë, kopjohet in vitro përmes denatyrimit, pjekjes, shtrirjes dhe hapave të tjerë.Është një teknologji e amplifikimit të sintezës së ADN-së in vitro, e cila mund të amplifikojë me shpejtësi dhe në mënyrë specifike çdo ADN të synuar in vitro.

w2

Përparësitë e PCR të zakonshme
1.Metoda klasike, standarde të plota ndërkombëtare dhe vendase
2.Kosto më e ulët e reagentëve të instrumenteve
3.Produktet PCR mund të rikuperohen për eksperimente të tjera të biologjisë molekulare
Makina e rekomanduar Foregene PCR: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Produkte të ngjashme: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Disavantazhet e PCR të zakonshme
1.lehtë për t'u ndotur
2.operacion i rëndë
3.vetëm analiza cilësore
4.Ndjeshmëri e moderuar
5.Ka përforcim jospecifik dhe kur brezi jospecifik ka të njëjtën madhësi me brezin e synuar, ai nuk mund të dallohet
 
CPCR e bazuar në elektroforezë apilare
Në përgjigje të mangësive të PCR të zakonshme, disa prodhues kanë prezantuar instrumente të bazuara në parimin e elektroforezës kapilar.Hapi i elektroforezës pas amplifikimit PCR përfundon në kapilar.Ndjeshmëria është më e lartë, dhe dallimi i disa bazave mund të dallohet dhe amplifikimi mund të llogaritet me MAERKER.përmbajtjen e produktit.Disavantazhi është se produkti PCR ende duhet të hapet dhe të futet në instrument, dhe ekziston ende një rrezik i madh kontaminimi.

w3

CapilareElektroforezë

 

2. Teknologjia sasiore fluoreshente PCR në kohë reale (Quantitative Real-time PCR, qPCR)PCR sasiore fluoreshente, e quajtur gjithashtu PCR në kohë reale, është një teknologji e re sasiore e acidit nukleik e zhvilluar nga PE (Perkin Elmer) në 1995. Historia e zhvillimit të PCR sasiore fluoreshente është një histori e betejave shpirtërore të gjigantëve si ABI, Roche dhe Bio-Rad.Nëse jeni të interesuar, mund ta kontrolloni.Kjo teknikë është aktualisht teknika gjysmë sasiore PCR më e pjekur dhe më e përdorur.

Makina qPCR e rekomanduar:https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/

Metoda e ngjyrosjes fluoreshente (SYBR Green I):SYBR Green I është boja lidhëse e ADN-së më e përdorur për PCR sasiore, e cila lidhet në mënyrë jo specifike me ADN-në me dy vargje.Në gjendje të lirë, SYBR Green lëshon fluoreshencë të dobët, por pasi lidhet me ADN-në me dy fije, fluoreshenca e tij rritet 1000-fish.Prandaj, sinjali total fluoreshent i emetuar nga një reaksion është proporcional me sasinë e pranishme të ADN-së me dy fije dhe do të rritet me rritjen e produktit të përforcuar.Meqenëse boja lidhet në mënyrë jo specifike me ADN-në me dy fije, mund të krijohen rezultate false pozitive.

Produkte të ngjashme: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/

Metoda e sondës fluoreshente (teknologjia Taqman): GjatëPërforcimi i PCR, një sondë fluoreshente specifike shtohet në të njëjtën kohë me një palë primerësh.Sonda është një oligonukleotid linear, me një grup raportues fluoreshent dhe një grup shues fluoreshent përkatësisht të etiketuar në të dy skajet.Kur sonda është e paprekur, sinjali fluoreshent i emetuar nga grupi i raportuesit absorbohet nga grupi shues dhe zbulimi Nuk ka sinjal fluoreshente;gjatë amplifikimit PCR (në fazën e shtrirjes), aktiviteti 5'-3' Dicer i enzimës Taq do të tretet dhe degradojë sondë, në mënyrë që grupi fluoreshent raportues dhe grupi fluoreshent shuarës të ndahen, në mënyrë që sistemi i monitorimit të fluoreshencës të mund të merret sinjali fluoreshent, domethënë, sa herë që kompletohet një ADN-ja, e cila është një fluoreshente. sinkronizimi i akumulimit të sinjaleve fluoreshente dhe formimi i produkteve PCR.Metoda e sondës Taqman është metoda më e përdorur e zbulimit në zbulimin klinik.

Produkte të ngjashme: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/

w4

Përparësitë e qPCR
1.Metoda është e pjekur dhe pajisjet mbështetëse dhe reagentët janë të kompletuar
2.Kostoja mesatare e reagentëve
3.lehtë për t'u përdorur
4.Ndjeshmëri dhe specifikë e lartë zbulimi
 
Disavantazhet e qPCR

Mutacioni i gjenit të synuar çon në zbulimin e humbur.
Rezultati i zbulimit të shabllonit me përqendrim të ulët nuk mund të përcaktohet.
Ka një gabim të madh kur përdoret kurba standarde për zbulimin sasior.
 
3. Teknologji dixhitale PCR (digital PCR, dPCR).
PCR dixhitale është një teknikë për përcaktimin e sasisë absolute të molekulave të acidit nukleik.Krahasuar me qPCR, PCR dixhitale mund të lexojë drejtpërdrejt numrin e molekulave të ADN/ARN-së, që është sasia absolute e molekulave të acidit nukleik në kampionin fillestar.Në vitin 1999, Bert Vogelstein dhe Kenneth W. Kin-zler propozuan zyrtarisht konceptin e dPCR.
 
Në vitin 2006, Fluidigm ishte i pari që prodhoi një instrument komercial dPCR të bazuar në çip.Në vitin 2009, Life Technologies lançoi sistemet OpenArray dhe QuantStudio 12K Flex dPCR.Në vitin 2013, Life Technologies lançoi sistemin QuantStudio 3DdPCR, i cili përdor teknologjinë e çipeve mikrofluidike me shkallë të lartë nano për të shpërndarë në mënyrë të barabartë mostrat në 20,000 qeliza individuale.në reaksion mirë.

w5

Në vitin 2011, Bio-Rad lançoi instrumentin QX100 dPCR të bazuar në pika, i cili përdor teknologjinë ujë në vaj për të shpërndarë në mënyrë të barabartë kampionin në 20,000 pika ujë në vaj dhe përdor një analizues pikash për të analizuar pikat.Në vitin 2012, RainDance lançoi instrumentin RainDrop dPCR, i drejtuar nga gazi me presion të lartë, për të ndarë çdo sistem reaksioni standard në një emulsion reagimi që përmban 1 milion deri në 10 milion mikropika të nivelit pikolitër.

w6

Deri më tani, PCR dixhitale ka formuar dy fraksione kryesore, llojin e çipit dhe llojin e pikave.Pavarësisht se çfarë lloj PCR dixhitale, parimet kryesore të saj janë hollimi kufizues, PCR e pikës përfundimtare dhe shpërndarja Poisson.Sistemi standard i reagimit PCR që përmban shabllone të acidit nukleik është i ndarë në mënyrë të barabartë në dhjetëra mijëra reaksione PCR, të cilat shpërndahen në çipa ose mikropika, në mënyrë që çdo reaksion të përmbajë sa më shumë që të jetë e mundur një molekulë shabllon dhe të kryhet një reaksion PCR shabllon me një molekulë.Me leximin e fluoreshencës numërohet prania ose mungesa e sinjalit dhe kuantifikimi absolut kryhet pas kalibrimit të shpërndarjes statistikore Poisson.

Më poshtë janë karakteristikat e disa platformave dixhitale PCR që kam përdorur:

1. Bio-Rad QX200 pika dixhitale PCR Bio-RadQX200 është një platformë dixhitale shumë klasike PCR, procesi bazë i zbulimit: 20,000 mostra gjenerohen nga gjeneratori i pikave Mikro-pikat ujë në vaj amplifikohen në një makinë të zakonshme PCR dhe në fund sinjali i fluoreshencës i secilës mikropikë lexohet nga një lexues mikropikësh.Operacioni është më i ndërlikuar, dhe rreziku i ndotjes është mesatar.

w7

PCR dixhitale me mikropika Xinyi TD1Xinyi TD1 është një platformë e brendshme dixhitale PCR, procesi bazë i zbulimit: gjeneroni 30,000-50,000 pika ujë në vaj përmes një gjeneratori pikash, përforconi në një instrument të zakonshëm PCR dhe më në fund kaloni Lexuesi i pikave lexon sinjalin fluoreshent të secilës pikë.Si gjenerimi i pikave ashtu edhe leximi në këtë platformë kryhen në një çip të dedikuar me rrezik të ulët kontaminimi.

w8

 PCR dixhitale me çip mikropikësh STILLA NaicaSTILLA Naica është një platformë relativisht e re dixhitale PCR.Procesi bazë i zbulimit është: shtoni tretësirën e reagimit në çip, vendosni çipin në sistemin e gjenerimit dhe amplifikimit të mikropikave dhe gjeneroni 30,000 mikropika.Përhapeni në çip dhe amplifikimi PCR përfundon në çip.Më pas çipi i përforcuar transferohet në sistemin e analizës së leximit të mikropikave dhe sinjali fluoreshent lexohet duke bërë fotografi.Meqenëse i gjithë procesi zhvillohet në një çip të mbyllur, rreziku i kontaminimit është i ulët.

w9

4. ThermoFisher QuantStudio 3D chip dixhital PCR

ThermoFisher QuantStudio 3D është një tjetër platformë klasike PCR dixhitale e bazuar në çip.Procesi i tij themelor i zbulimit është: shtoni tretësirën e reaksionit në shpërndarësin dhe shpërndani tretësirën e reaksionit në mënyrë të barabartë në çip me 20,000 mikropusha përmes shpërndarësit., vendosni çipin në makinën PCR për t'u përforcuar dhe në fund vendoseni çipin në lexues dhe bëni një foto për të lexuar sinjalin fluoreshent.Operacioni është relativisht i ndërlikuar dhe i gjithë procesi kryhet në një çip të mbyllur dhe rreziku i ndotjes është i ulët.

w10

5. JN MEDSYS Clarity chip dixhital PCR

JN MEDSYS Clarity është një platformë dixhitale PCR relativisht e re e tipit çip.Procesi i tij themelor i zbulimit është: shtoni tretësirën e reaksionit në aplikues dhe shpërndani tretësirën e reaksionit në mënyrë të barabartë në 10,000 tuba PCR të fiksuara në tubin PCR përmes aplikuesit.Në çipin mikroporoz, tretësira e reaksionit hyn në çip përmes veprimit kapilar, dhe tubi PCR me çipin vendoset në makinën PCR për amplifikimin, dhe në fund çipi futet në lexues për të lexuar sinjalin fluoreshent duke bërë një foto.Operacioni është më i ndërlikuar.Rreziku i kontaminimit është i ulët.

w11

Parametrat e secilës platformë dixhitale PCR përmblidhen si më poshtë:

w12

Treguesit e vlerësimit të platformës dixhitale PCR janë: numri i njësive të ndara, numri i kanaleve fluoreshente, kompleksiteti i funksionimit dhe rreziku i kontaminimit.Por gjëja më e rëndësishme është saktësia e zbulimit.Një mënyrë për të vlerësuar platformat dixhitale PCR është përdorimi i platformave të shumta dixhitale PCR për të verifikuar njëra-tjetrën dhe një mënyrë tjetër është përdorimi i substancave standarde me vlera të sakta.

Përparësitë e dPCR
1.Arritja e kuantifikimit absolut
2.Ndjeshmëri dhe specifikë më e lartë
3.Mund të zbulojë mostra me kopje të ulëta
Disavantazhet e dPCR1. Pajisjet dhe reagentët e shtrenjtë 2. Funksionimi i komplikuar dhe koha e gjatë e zbulimit 3. Gama e ngushtë e zbulimit

Aktualisht, tre gjeneratat e teknologjisë PCR kanë avantazhet dhe disavantazhet e tyre, dhe secila ka fushat e veta të aplikimit dhe nuk është një marrëdhënie që një brez të zëvendësojë tjetrin.Përparimi i vazhdueshëm i teknologjisë ka injektuar vitalitet të ri në teknologjinë PCR, duke i mundësuar asaj të zhbllokojë një drejtim aplikimi pas tjetrit, duke e bërë zbulimin e acidit nukleik më të përshtatshëm dhe të saktë.
Burimi: Dr. Yuan ju merr për testim
 
Produktet e rekomanduara:


Koha e postimit: Nëntor-18-2022