Materiali fillestar: ARN
PCR e transkriptimit sasior të kundërt (RT-qPCR) është një metodë eksperimentale e përdorur në eksperimentet PCR duke përdorur ARN-në si material fillestar.Në këtë metodë, ARN totale ose ARN mesazhere (mRNA) transkriptohet fillimisht në ADN plotësuese (cDNA) nga transkriptaza e kundërt.Më pas, u krye një reaksion qPCR duke përdorur cDNA si shabllon.RT-qPCR është përdorur në një sërë aplikacionesh të biologjisë molekulare, duke përfshirë analizën e shprehjes së gjeneve, vlefshmërinë e ndërhyrjes së ARN-së, vërtetimin e mikroarresë, zbulimin e patogjenit, testimin gjenetik dhe kërkimin e sëmundjeve.
Metodat me një hap dhe dy hapa për RT-qPCR
RT-qPCR mund të realizohet me një metodë me një ose dy hapa.RT-qPCR me një hap kombinon transkriptimin e kundërt dhe amplifikimin PCR, duke lejuar transkriptazën e kundërt dhe ADN polimerazën të përfundojnë reaksionin në të njëjtin tub në të njëjtat kushte tampon.RT-qPCR me një hap kërkon vetëm përdorimin e primerëve të sekuencës specifike.Në RT-qPCR me dy hapa, transkriptimi i kundërt dhe amplifikimi PCR kryhen në dy tuba, duke përdorur buferë të ndryshëm të optimizuar, kushte reagimi dhe strategji të projektimit të primerit.
Avantazhi | Disavantazhi | |
Nje hap | Kjo metodë ka më pak gabime eksperimentale pasi të dy reagimet bëhen në një tub
Më pak hapa me tubacion zvogëlojnë rrezikun e kontaminimit
I përshtatshëm për përforcim/shqyrtim me fuqi të lartë, i shpejtë dhe i riprodhueshëm | Reagimet me dy hapa nuk mund të optimizohen veçmas
Meqenëse kushtet e reagimit rrezikohen duke kombinuar reagimin me dy hapa, ndjeshmëria nuk është aq e mirë sa ajo e metodës me dy hapa
Numri i objektivave të zbuluar nga një kampion i vetëm është i vogël |
Dy hapa | Aftësia për të krijuar biblioteka të qëndrueshme cDNA që mund të ruhen për periudha të gjata kohore dhe të përdoren në reagime të shumta
Gjenet e synuara dhe gjenet e referencës mund të amplifikohen nga e njëjta bibliotekë cDNA pa pasur nevojë për biblioteka të shumta cDNA
Tamponët e reagimit dhe kushtet e reagimit që mundësojnë optimizimin e ekzekutimeve të një reaksioni
Zgjedhje fleksibile e kushteve të shkrepjes | Përdorimi i tubave të shumtë dhe më shumë hapave të tubimit rrit rrezikun e kontaminimit të ADN-së, dhe kërkon kohë.
Kërkon më shumë optimizim sesa metoda me një hap |
Produkte të ngjashme:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Një hap)-SYBR Gjelbër I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Një hap)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix Për Sintezën CDNA të Fillesës së Parë
Paketa Easyᵀᴹ-SYBR Green I PCR në kohë reale
PCR në kohë reale Easyᵀᴹ-Taqman
Përzgjedhja e ARN totale dhe mARN
Kur hartoni një eksperiment RT-qPCR, është e rëndësishme të vendosni nëse do të përdorni ARN totale ose mRNA të pastruar si një shabllon për transkriptimin e kundërt.Megjithëse mRNA mund të jetë në gjendje të sigurojë ndjeshmëri pak më të lartë, ARN totale ende përdoret shpesh.Arsyeja për këtë është se ARN totale ka një avantazh më të rëndësishëm si material fillestar sesa mRNA.Së pari, procesi kërkon më pak hapa pastrimi, gjë që siguron rikuperim më të mirë sasior të shabllonit dhe normalizim më të mirë të rezultateve në numrat fillestarë të qelizave.Së dyti, shmang hapin e pasurimit të mARN-së, i cili mund të shmangë mundësinë e rezultateve të shtrembëruara për shkak të rikuperimeve të ndryshme të mARN-ve të ndryshme.Në përgjithësi, meqenëse në shumicën e aplikacioneve sasia relative e gjenit të synuar është më e rëndësishme sesa ndjeshmëria absolute e zbulimit, ARN totale është më e përshtatshme në shumicën e rasteve.
Abetare e transkriptimit të kundërt
Në metodën me dy hapa, tre metoda të ndryshme mund të përdoren për të përgatitur reaksionin cDNA: primerë oligo(dT), primerë të rastësishëm ose primerë specifikë të sekuencës.Në mënyrë tipike, primerët oligo(dT) dhe primerët e rastësishëm përdoren në kombinim.Këta abetare kalojnë në vargun e modelit mRNA dhe sigurojnë transkriptazën e kundërt me një pikënisje për sintezën.
Zgjedhja e abetareve | Struktura dhe funksioni | Avantazhi | Disavantazhi |
Abetare oligo(dT) (ose abetare e ankoruar oligo(dT)) | Pjekja e zgjatur ndaj mbetjeve të timinës në bishtin poli(A) të mARN-së;Abetarja e ankorimit oligo(dT) përmban një G, C ose A në fundin 3' (vend i ankorimit) | Sinteza e cDNA me gjatësi të plotë nga mRNA me bisht poli(A).
Zbatohet kur disponohet më pak material fillestar
Vendi i ankorimit siguron që primeri oligo(dT) të lidhet me bishtin poli(A) 5' të mARN-së | I përshtatshëm vetëm për amplifikimin e gjeneve me bisht poli(A).
Merrni cDNA të cunguar nga vendi priming*2 në poli(A)
I njëanshëm për t'u lidhur në fundin 3'*
*Kjo mundësi minimizohet nëse përdoren primerë të ankoruar oligo(dT). |
abetare e rastësishme
| 6 deri në 9 baza në gjatësi, të cilat mund të kalojnë në shumë vende gjatë transkriptimit të ARN-së | Pjekja ndaj të gjitha ARN-ve (tRNA, rRNA dhe mARN)
I përshtatshëm për transkriptet me strukturë dytësore të rëndësishme, ose kur disponohet më pak material fillestar
Rendiment i lartë i cADN-së | cDNA transkriptohet në të kundërt nga e gjithë ARN, e cila zakonisht nuk është e dëshiruar dhe mund të hollojë sinjalin e mARN-së së synuar
merrni cDNA të cunguar |
abetare specifike për sekuencën | Primerë të personalizuar që synojnë sekuenca specifike të mRNA | bibliotekë specifike cADN
Përmirësoni ndjeshmërinë
Përdorimi i primerëve të kundërt qPCR | Kufizohet vetëm në sintezën e një gjeni të vetëm objektiv |
Transkriptaza e kundërt
Transkriptaza e kundërt është një enzimë që përdor ARN për të sintetizuar ADN-në.Disa transkriptaza të kundërta kanë aktivitet RNase dhe mund të degradojnë vargjet e ARN-së në vargjet hibride ARN-ADN pas transkriptimit.Nëse nuk ka aktivitet enzimatik RNase, RNaseH mund të shtohet për efikasitet më të lartë qPCR.Enzimat e përdorura zakonisht përfshijnë transkriptazën e kundërt të virusit të leucemisë së miut Moloney dhe transkriptazën e kundërt të virusit të mieloblastomës së shpendëve.Për RT-qPCR, është ideale të zgjidhet një transkriptazë e kundërt me termostabilitet më të lartë, në mënyrë që sinteza e cDNA të mund të kryhet në temperatura më të larta, duke siguruar transkriptim të suksesshëm të ARN-ve me strukturë dytësore më të lartë, duke ruajtur aktivitetin e tyre të plotë gjatë gjithë reagimit, duke rezultuar në rendimente më të larta të cDNA.
Produkte të ngjashme:
Transkriptaza e kundërt Foreasy M-MLV
Aktiviteti i RNazës H të transkriptazës së kundërt
RNaseH është në gjendje të degradojë vargjet e ARN-së nga duplekset ARN-ADN, duke lejuar sintezën efikase të ADN-së me dy vargje.Megjithatë, kur përdoret mARN e gjatë si shabllon, ARN mund të degradohet para kohe, duke rezultuar në cDNA të cunguar.Prandaj, është shpesh e dobishme të minimizohet aktiviteti i RNaseH gjatë klonimit të cDNA nëse dëshirohet sinteza e transkripteve të gjata.Në të kundërt, transkriptazat e kundërta me aktivitet RNase H janë shpesh të dobishme për aplikimet qPCR sepse ato përmirësojnë shkrirjen e duplekseve ARN-ADN gjatë ciklit të parë të PCR.
Dizajni i primerit
Primerët PCR të përdorura për hapin qPCR në RT-qPCR duhet të projektohen në mënyrë ideale për të shtrirë një bashkim ekzon-ekzon, ku një primer përforcues mund të shtrijë potencialisht një kufi aktual ekzon-intro.Meqenëse sekuencat e ADN-së gjenomike që përmbajnë intron nuk përforcohen, ky dizajn redukton rrezikun e pozitivëve të rremë të përforcuar nga kontaminimi i ADN-së gjenomike.
Nëse primerët nuk mund të projektohen për të ndarë kufijtë e ekzoneve ose ekzon-eksonit, mund të jetë e nevojshme të trajtohen mostrat e ARN-së me DNazë I ose dsDNazë pa RNazë për të hequr kontaminimin gjenomik të ADN-së.
Kontrolli RT-qPCR
Një kontroll negativ i transkriptimit të kundërt (kontrolli -RT) duhet të përfshihet në të gjitha eksperimentet RT-qPCR për të zbuluar kontaminimin e ADN-së (si ADN-ja gjenomike ose produktet PCR nga reaksionet e mëparshme).Ky kontroll përmban të gjithë komponentët e reaksionit përveç transkriptazës së kundërt.Meqenëse transkriptimi i kundërt nuk ndodh me këtë kontroll, nëse vërehet amplifikimi i PCR-së, ka shumë të ngjarë të ketë kontaminim nga ADN-ja.
Koha e postimit: Gusht-02-2022