Udhëzues për analizën e problemit

Analiza e mëposhtme e problemeve që mund të hasniTotali i bimëveRNA extraction will help you with your experiments. In addition, for other experimental or technical problems in addition to operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. If you have any needs, please contact us at: 028-83360257 or E-mali : Tech@foregene.com.

Kolona e rrotullimit është e bllokuar

Bllokimi i kolonës spin do të bëjë që rendimenti i ARN-së të reduktohet ose madje të mos jetë në gjendje të pastrohet për të marrë ARN, dhe cilësia e ARN-së së marrë do të jetë e ulët.

Analiza e shkakut të përbashkët:

1. Mostra nuk është thyer plotësisht.

Fragmentimi jo i plotë i mostrës mund të bllokojë kolonën e pastrimit të ADN-së, e cila gjithashtu mund të ndikojë në rendimentin dhe cilësinë e ARN-së.Ne rekomandojmë që gjatë kryerjes së fragmentimit të mostrës, të bluani shpejt në sasi të mjaftueshme të azotit të lëngshëm për të copëtuar sa më shumë indet si muret qelizore dhe membranat qelizore të mostrave.Për mostrat bimore të polisaharideve të polifenolit, ju rekomandojmë që të përdorni Plant Total RNA Isolation Kit Plus.

2. Aspironi supernatantin e izoluar të kolonës së pastrimit të ADN-së, aspironi peletin e mundshëm të mbeturinave qelizore.

Peleta e mbeturinave qelizore të aspiruara mund të bllokojnë kolonën vetëm me ARN gjatë procedurave të adsorbimit të ARN-së (shih hapin 5 të procedurës, hapin 6 të procedurës së polifenolit polisakarid).Ne rekomandojmë që duhet pasur kujdes gjatë aspirimit të këtij supernatanti për të shmangur aspirimin e mbetjeve qelizore.

3. Sasia fillestare e mostrës është shumë e madhe.

Përdorimi i tepërt i mostrës do të rezultojë në fragmentim jo të plotë të mostrës ose lizë jo të plotë të qelizave nga Buffer PRL1 ose Buffer PSL1, duke rezultuar në bllokimin e kolonës së pastrimit për operacionet e pastrimit.Kompleti i izolimit total të ARN-së së bimëve ka një maksimum fillestar prej 50 mg për pastrim të vetëm të një kampioni të operuar.Për mostrat bimore të polisaharideve të polifenolit, ju rekomandojmë të provoni Plant Total RNA Isolation Kit Plus.

4. Temperatura e centrifugës është shumë e ulët.

Izolimi dhe pastrimi i plotë i ARN-së, përveç përçarjes së azotit të lëngshëm të indit të mostrës, të gjitha hapat kryhen në temperaturën e dhomës (20-25 °C).Disa centrifuga me temperaturë të ulët kanë temperatura nën 20 °C, gjë që mund të shkaktojë bllokime në kolonën e pastrimit të ADN-së dhe/ose në kolonën vetëm me ARN.Nëse kjo ndodh, vendosni temperaturën e centrifugës në 20-25 °C dhe ngrohni paraprakisht përzierjen e lizës dhe/ose shtimin e supernatantit të ndarjes së etanolit në 37 °C.

Asnjë ARN nuk është nxjerrë ose rendimenti i ARN-së është i ulët

Zakonisht ka shumë faktorë që ndikojnë në efikasitetin e rikuperimit, si: përmbajtja e ARN-së së mostrës, mënyra e funksionimit, vëllimi i elucionit, etj.

Analiza e shkaqeve të zakonshme si më poshtë:

1. Gjatë operacionit është kryer një banjë akulli ose centrifugim në temperaturë të ulët (4°C).

Sugjerim: Punoni në temperaturën e dhomës (15-25°C) gjatë gjithë procesit, mos bëni banjë akulli dhe centrifugim në temperaturë të ulët.

       2.ARN është degraduar për shkak të ruajtjes jo të duhur të kampionit ose ruajtjes afatgjatë të kampionit.

Rekomandim: Mostrat e sapo mbledhura duhet të ngrihen shpejt në azot të lëngshëm dhe më pas të ruhen në -80°C për një kohë të gjatë, të shmangni ngrirjen dhe shkrirjen e përsëritur të mostrave;ose njomni menjëherë mostrat në tretësirën e stabilizatorit të ARN-së RNA më vonë (mostrat e kafshëve).

       3.Fragmentimi dhe liza e pamjaftueshme e mostrës çojnë në bllokimin e kolonës së pastrimit.

Sugjerim: Kur bluani indet, ju lutemi sigurohuni që indi është bluar mjaftueshëm dhe transferojeni shpejt në tampon PSL1 të përgatitur paraprakisht (konfirmoni që proporcioni i saktë i β-ME është shtuar, shihni hapin 1 të procedurës).

4.Eluenti është shtuar gabimisht.

Sugjerim: Sigurohuni që ddH pa RNase₂O hidhet në mes të membranës së kolonës së pastrimit.

5. Vëllimi i saktë i etanolit absolut nuk iu shtua Buffer PSL2 ose Buffer PRW2.

Sugjerim: Ju lutemi ndiqni udhëzimet, shtoni volumin e saktë të etanolit absolut në Buffer PSL2 dhe Buffer PRW2 dhe përzieni mirë përpara se të përdoret kompleti.

6. Sasia e mostrës së indeve është e papërshtatshme.

Sugjerim: Përdorni 50 mg ind për 500 μl Buffer PSL1.Përdorimi i shumë indeve do të zvogëlojë sasinë e ARN-së së nxjerrë dhe pastërtia e ARN-së që rezulton gjithashtu do të reduktohet.Ne rekomandojmë fuqimisht që doza fillestare e mostrës nuk duhet të kalojë 50 mg për operacion të nxjerrjes së ARN-së.

7. Vëllimi i papërshtatshëm i elucionit ose elucioni jo i plotë.

Sugjerim: Vëllimi i eluentit të kolonës së pastrimit është 50-200 μl;nëse efekti i elucionit nuk është i kënaqshëm, rekomandohet të zgjatet koha në temperaturën e dhomës pas shtimit të ddH të ngrohur pa RNase₂O, si p.sh. 5-10min.

8. Kolona e pastrimit ka mbetje etanoli pas larjes me Buffer PRW2.

   Sugjerim: Nëse tubi i zbrazët centrifugohet për 1 min dhe ka mbetur ende etanol pas larjes në tampon PRW2, mund ta rrisni kohën e centrifugimit të tubit bosh në 2 min, ose ta vendosni kolonën e pastrimit në temperaturën e dhomës për 5 min për të hequr plotësisht etanolin e mbetur.

9. Kompleti është përdorur gabimisht.

   Sugjerim: Për mostrat bimore të polisaharideve polifenolike, përdorimi i kompleteve të zakonshme si Kompleti i izolimit të ARN totale të bimëve mund të mos jetë në gjendje të marrë mostra ideale të ARN-së.Ne ju rekomandojmë të përdorni Plant Total RNA IsolationKit Plus, i cili është krijuar posaçërisht për mostrat e bimëve polifenolike polisakaride.Një komplet i zhvilluar posaçërisht për nxjerrjen e ARN-së nga mostrat e bimëve të polifenolit dhe polisaharidit.

Vlera OD260/OD280 është e ulët

Elucioni i ARN-së me ddH₂O dhe përdoret për leximet e spektrofotometrit rezulton në vlera të ulëta OD260/OD280.Ne rekomandojmë përdorimin e 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 (në vend të ddH pa RNase₂O për të elutuar ARN) për të marrë vlera relativisht të sakta OD260/OD280, shihni “Analizat e përqendrimit dhe pastrimit të ARN” në faqen 19.

ARN-ja e pastruar degradohet

Cilësia e ARN-së së pastruar lidhet me faktorë të tillë si ruajtja e mostrës, kontaminimi me RNase dhe manipulimi.

Analiza e shkaqeve të zakonshme:

1. Mostrat e indeve nuk u ruajtën në kohë pas grumbullimit.

    Rekomandim: Nëse mostrat e indeve nuk përdoren në kohë pas grumbullimit, ju lutemi ruani ato në azot të lëngshëm në temperaturë të ulët menjëherë ose transferojini në -80°C për ruajtje afatgjatë pas ngrirjes së shpejtë në azot të lëngshëm, ose zhytni menjëherë kampionët në tretësirën e stabilizuesit të ARN-së RNA më vonë (mostrat e kafshëve ).Për nxjerrjen e ARN-së, përpiquni të përdorni mostrat e indeve të mbledhura fllad.

2.Ngrirja dhe shkrirja e përsëritur e mostrave të indeve.

   Sugjerim: Gjatë ruajtjes së mostrave të indeve, është mirë që ato të priten në copa të vogla për t'u ruajtur dhe të hiqet një pjesë e tyre kur i përdorni për të shmangur degradimin e ARN-së të shkaktuar nga ngrirja dhe shkrirja e përsëritur e mostrave.

3.RNase futet në sallën e operacionit ose nuk përdoren doreza njëpërdorimshe, maska, etj.

   Sugjerim: Eksperimentet e nxjerrjes së ARN-së kryhen më së miri në operacione të veçanta të ARN-së dhe tabela e laboratorit duhet të pastrohet përpara eksperimentit dhe gjatë eksperimentit duhet të vishen doreza dhe maska ​​njëpërdorimshme për të shmangur degradimin e ARN-së të shkaktuar nga futja e RNase në masën më të madhe.

4. Reagenti kontaminohet nga RNase gjatë përdorimit.

   Sugjerim: Zëvendësoni me një seri të re komplete të nxjerrjes së ARN-së totale të bimëve për eksperimentet përkatëse.

5. Tubat e centrifugës dhe majat e pipetës që përdoren për manipulimin e ARN-së janë të kontaminuara me RNase.

Sugjerim: Sigurohuni që tubat e centrifugës, majat e pipetave, pipetat, etj. të përdorura në nxjerrjen e ARN-së janë të gjitha pa RNase.

Manualet e udhëzimeve:

Manuali i Udhëzimeve të Kompletit të Izolimit të ARN-së totale të bimëve