Në fazën e hershme të shpërthimit, për shkak të zhvillimit të shpejtë, diagnostikimi i shpejtë i pacientëve të dyshuar është çelësi për parandalimin e COVID-19.Disa reagentë të miratuar për zbulimin e acidit nukleik kanë një kohë të shkurtër zhvillimi dhe ka probleme të tilla si konfirmimi i shpejtë i performancës, optimizimi i pamjaftueshëm i reagentëve dhe dallime të mëdha midis grupeve;Problemet e laboratorëve të ndryshëm klinikë në aspekte të ndryshme të procesit të zbulimit të acidit nukleik mund të ndikojnë gjithashtu në saktësinë e rezultateve të zbulimit të acidit nukleik.Ky artikull do të fokusohet në lidhjet dhe pikat kryesore në zbulimin aktual të acidit nukleik SARS-CoV-2 dhe do të analizojë problemet e riekzaminimit të rremë negativ dhe pozitiv të zbulimit të acidit nukleik laboratorik dhe mospërputhjes klinike.

Parimet e zbulimit të acidit nukleik SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 është një virus ARN me një sekuencë gjenomi prej rreth 29 kb, me 10 gjene, të cilat mund të kodojnë në mënyrë efektive 10 proteina.Viruset përbëhen nga ARN dhe proteina, dhe shtresa më e jashtme është një shtresë e jashtme e përbërë nga lipide dhe glikoproteina.Brenda, kapsidi i proteinës mbështjell ARN-në në të, duke mbrojtur kështu ARN-në lehtësisht të degradueshme (P1).

P1 Struktura e SARS-COV-2

Viruset pushtojnë qelizat përmes receptorëve specifikë të sipërfaqes së qelizave për të shkaktuar infeksion dhe përdorin qelizat pritëse për t'u shumuar.

Parimi i zbulimit të acidit nukleik viral është ekspozimi i ARN-së virale përmes një lizati qelizor dhe më pas përdorimi i reaksionit zinxhir të transkriptimit të kundërt fluoreshent-polimerazë (RT-PCR) në kohë reale për zbulim.

Çelësi i parimit të zbulimit është përdorimi i abetareve dhe sondave për të arritur "përputhjen e synuar" të sekuencave të acidit nukleik, domethënë, për të gjetur sekuencën e acidit nukleik të SARS-CoV-2 që është e ndryshme nga viruset e tjera në rreth 30,000 baza (ngjashmëria e acidit nukleik me viruset e tjerë) Zona "e ulët" e abetares dhe sondës).

Primerët dhe sondat përputhen shumë me rajonin specifik të acidit nukleik SARS-CoV-2, domethënë specifika është shumë e fortë.Pasi rezultati i amplifikimit RT-PCR fluoreshente në kohë reale të kampionit që do të testohet është pozitiv, provon se SARS-CoV-2 është i pranishëm në kampion.Shih P2.

P2 Hapat e përcaktimit të acidit nukleik SARS-CoV-2 (RT-PCR fluoreshente në kohë reale)

Kushtet dhe kërkesat e laboratorit për zbulimin e acidit nukleik SARS-CoV-2

Laboratorët e testimit të acidit nukleik janë më idealet për mjediset me presion negativ dhe ata duhet t'i kushtojnë vëmendje monitorimit të presionit, të mbajnë ajrin të rrjedhë dhe të eliminojnë aerosolet.Personeli i testimit të acidit nukleik duhet të ketë kualifikimet përkatëse, të marrë trajnimin përkatës të reaksionit zinxhir polimerazë dhe të kalojë vlerësimin.Laboratori duhet të menaxhohet rreptësisht, të zonohet në vend dhe personeli i parëndësishëm është rreptësisht i ndaluar të hyjë.Zona e pastër duhet të ajroset dhe dezinfektohet në vend.Artikujt përkatës vendosen në zona, të pastra dhe të pista ndahen, zëvendësohen në kohë dhe dekontaminohen në vend.Dezinfektimi rutinë: Dezinfektuesi që përmban klor është zgjidhja kryesore për zona më të mëdha, dhe alkool 75% mund të përdoret për zona të vogla.Një mënyrë e mirë për t'u marrë me aerosolët është hapja e dritareve për ajrim, dhe dezinfektimi i ajrit mund të kryhet edhe me anë të rrezeve ultravjollcë, filtrimit dhe dezinfektimit të ajrit.

Lidhjet kryesore dhe parametrat e përcaktimit të acidit nukleik SARS-CoV-2 (RT-PCR fluoreshente në kohë reale)

Megjithëse laboratorët në përgjithësi i kushtojnë vëmendje të madhe “zbulimit” të acidit nukleik, në fakt, “nxjerrja” e acidit nukleik është gjithashtu një nga hapat kyç për zbulimin e suksesshëm, i cili lidhet ngushtë me mbledhjen dhe ruajtjen e mostrave të virusit.

Aktualisht, mostrat respiratore më të përdorura, siç janë tamponët nazofaringeale, përdorin metodën e dytë, e cila është një tretësirë ​​inaktivuese (konservuese) e përgatitur në bazë të ekstraktimit të acidit nukleik dhe tretësirës së lizës.Nga njëra anë, kjo zgjidhje e ruajtjes së virusit mund të denatyrojë proteinën e virusit, të humbasë aktivitetin e saj dhe të mos jetë më infektive dhe të përmirësojë sigurinë e fazës së transportit dhe zbulimit;nga ana tjetër, ai mund të godasë drejtpërdrejt virusin për të lëshuar acidin nukleik, për të eliminuar enzimën dekompozuese të acidit nukleik dhe për të parandaluar virusin.ARN është e degraduar.

Një zgjidhje për marrjen e mostrave të virusit e përgatitur në bazë të tretësirës së lizës së ekstraktimit të acidit nukleik.Përbërësit kryesorë janë kripërat e balancuara, agjenti kelatues i acidit etilendiaminetraacetik, kripa e guanidinës (izotiocianat guanidine, hidroklorur guanidine, etj.), surfaktant anionik (dodekani) sulfat natriumi), surfaktant kationik (tetradecil trimetilat 8, proteinothinoloks, proteinothinoloks, proteinoks, thioloks. ase K dhe disa ose më shumë komponentë të tjerë.Aktualisht, ka shumë lloje të kompleteve të nxjerrjes së acidit nukleik dhe përdoren reagentë të ndryshëm për nxjerrjen dhe pastrimin e acidit nukleik.Edhe nëse përdoret i njëjti reagent për nxjerrjen dhe pastrimin e acidit nukleik, procedurat e nxjerrjes së çdo komplete janë të ndryshme.

Aktualisht, produktet e kompletit të zbulimit të acidit nukleik të miratuar nga Administrata Kombëtare e Produkteve Mjekësore zgjidhen bazuar në gjenet ORF1ab, E dhe N në gjenomin SARS-CoV-2.Parimet e zbulimit të produkteve të ndryshme janë në thelb të njëjta, por abetaret dhe modelet e tyre të sondës janë të ndryshme.Ekzistojnë segmente me një objektiv (ORF1ab), segmente me objektiv të dyfishtë (ORF1ab, N ose E) dhe segmente me tre synime (ORF1ab, N dhe E).Dallimi midis zbulimit dhe interpretimit, nxjerrjes së acidit nukleik dhe sistemit të reagimit fluoreshent RT-PCR në kohë reale duhet t'i referohet udhëzimeve përkatëse të kompletit dhe rekomandohet që përdoruesit të ndjekin rreptësisht metodën e interpretimit të specifikuar në udhëzimet e kompletit për interpretim.Rajonet e zakonshme, primerët dhe sekuencat e sondave të përforcuara nga RT-PCR fluoreshente në kohë reale janë paraqitur në P3.

P3 Vendndodhja e objektivit të amplikonit SARS-CoV-2 në gjenom dhe sekuenca e primerëve dhe sondave

Interpretimi i rezultateve të përcaktimit të acidit nukleik SARS-CoV-2 (Real-Time fluoreshente RT-PCR)

“Plani i Parandalimit dhe Kontrollit të Pneumonisë për Infeksionin SARS-CoV-2 (Edicioni i dytë)” për herë të parë sqaroi kriteret për gjykimin e rezultateve të amplifikimit të një gjeni:

1. Asnjë Ct ose Ct≥40 nuk është negativ;

2. Ct<37 është pozitive;

3. Vlera Ct prej 37-40 është zona e shkallës gri.Rekomandohet të përsëritet eksperimenti.Nëse rezultati i ribërjes së Ct<40 dhe kurba e amplifikimit ka maja të dukshme, kampioni vlerësohet si pozitiv, përndryshe është negativ.

Edicioni i tretë i udhëzuesit dhe botimi i katërt i udhëzuesit vazhduan kriteret e mësipërme.Megjithatë, për shkak të objektivave të ndryshëm të përdorur në kompletet komerciale, botimi i tretë i sipërpërmendur i udhëzuesit nuk ka dhënë kriteret për përcaktimin e kombinimit të objektivave, duke theksuar Udhëzimet e dhëna nga prodhuesi do të mbizotërojnë.Duke filluar nga edicioni i pestë i udhëzimeve, dy objektiva janë sqaruar, veçanërisht kriteret e gjykimit për një objektiv të vetëm që është i vështirë për t'u gjykuar.Kjo do të thotë, nëse laboratori dëshiron të konfirmojë që një rast është pozitiv për zbulimin e acidit nukleik SARS-CoV-2, duhet të plotësohen 1 nga 2 kushtet e mëposhtme:

(1) Dy objektiva të SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) në të njëjtin mostër janë testuar pozitivë me RT-PCR fluoreshente në kohë reale.Nëse një objektiv i vetëm është pozitiv, kërkohet ri-kampionimi dhe ritestimi.Nëse rezultatet e testit janë Nëse objektivi i vetëm është ende pozitiv, ai vlerësohet si pozitiv.

(2) Dy mostra të RT-PCR fluoreshente në kohë reale treguan një objektiv të vetëm pozitiv në të njëjtën kohë ose dy mostra të të njëjtit lloj treguan një rezultat të testit pozitiv të objektivit të vetëm, i cili mund të gjykohet si pozitiv.Megjithatë, udhëzimet theksojnë gjithashtu se rezultatet negative të testimit të acidit nukleik nuk mund të përjashtojnë infeksionin SARS-CoV-2.Faktorët që mund të shkaktojnë negativë të rremë duhet të përjashtohen, duke përfshirë cilësinë e dobët të kampionit (mostrat e frymëmarrjes nga orofaringu dhe pjesët e tjera), mbledhja e mostrave shumë herët ose shumë vonë, mostrat nuk u ruajtën, transportuan dhe nuk u përpunuan siç duhet dhe vetë teknologjia kishte probleme (ndryshimi i virusit, frenimi i PCR), etj.

Shkaqet e negativëve të rremë në zbulimin e SARS-CoV-2

Koncepti "negativ i rremë" në testimin e acidit nukleik që është aktualisht i shqetësuar, shpesh i referohet "negativëve të rremë" në të cilët rezultatet e testit të acidit nukleik nuk janë në përputhje me manifestimet klinike, domethënë simptomat klinike dhe rezultatet e imazhit dyshohen shumë për COVID-19, por testet e acidit nukleik janë gjithmonë "negative" shumë herë.Qendra Klinike Laboratorike e Komisionit Kombëtar të Shëndetësisë shpjegoi testin “false negativ” SARS-CoV-2.

(1) Ekziston një sasi e caktuar e virusit në qelizat e personit të infektuar.Të dhënat ekzistuese tregojnë se pasi trupi infektohet nga virusi, virusi hyn në fyt përmes hundës dhe gojës, më pas në trake dhe bronke dhe më pas arrin në alveola.Personi i infektuar do të përjetojë periudhën e inkubacionit, simptomat e lehta dhe më pas procesin e simptomave të rënda dhe fazat e ndryshme të sëmundjes.Dhe sasia e virusit të pranishëm në pjesë të ndryshme të trupit është e ndryshme.

Përsa i përket ngarkesës virale të llojeve të qelizave, qelizat epiteliale alveolare (trakti i poshtëm respirator)> qelizat epiteliale të rrugëve të frymëmarrjes (trakti i sipërm respirator)> fibroblastet, qelizat endoteliale dhe makrofagët, etj.;nga lloji i kampionit, lëngu i lavazhit alveolar (më i shkëlqyeri)> pështymë me kollë të thellë> shtupë nazofaringeale> shtupë orofaringeale> gjak.Përveç kësaj, virusi mund të zbulohet edhe në feces.Megjithatë, duke marrë parasysh komoditetin e operacionit dhe pranimin e pacientëve, renditja e mostrës klinike e përdorur zakonisht është shtupë orofaringeale> shtupë nazofaringeale> lëngu i lavazhit bronkial (operacion kompleks) dhe pështymë e thellë (zakonisht kollë e thatë, e vështirë për t'u marrë).

Prandaj, sasia e virusit në qelizat e orofaringut ose nazofaringit të disa pacientëve është e vogël ose jashtëzakonisht e ulët.Nëse merren vetëm mostra të orofaringut ose nazofaringit për testim, acidi nukleik viral nuk do të zbulohet.

(2) Asnjë qelizë që përmban virus nuk u mblodh gjatë mbledhjes së mostrës, ose acidi nukleik viral nuk u ruajt në mënyrë efektive.

[① Vend grumbullimi jo i duhur, për shembull, kur mblidhen tamponat orofaringeale, thellësia e grumbullimit nuk është e mjaftueshme, strishat e mbledhura nazofaringeale nuk mblidhen thellë në zgavrën e hundës, etj. Shumica e qelizave të mbledhura mund të jenë qeliza pa viruse;

② Tamponët e kampionimit janë përdorur gabimisht.Për shembull, për materialin e kokës së shtupës rekomandohen fibra sintetike si fibra PE, fibra poliester dhe fibra polipropileni.Fibrat natyrale si pambuku përdoren në funksionimin aktual (adsorbimi i fortë i proteinave dhe jo i lehtë për t'u larë) dhe fibrat najloni (thithja e dobët e ujit, që çon në volum të pamjaftueshëm të marrjes së mostrave);

③Përdorimi i gabuar i tubave të ruajtjes së virusit, si p.sh. keqpërdorimi i tubave të ruajtjes së polipropilenit ose polietileni plastike që absorbohen lehtë acidet nukleike (ADN/ARN), duke rezultuar në një ulje të përqendrimit të acidit nukleik në tretësirën e ruajtjes.Në praktikë, rekomandohet përdorimi i plastikës polimer polietileni-propilen dhe disa enë plastike polipropileni të trajtuara posaçërisht për të ruajtur acidet nukleike virale.]

[① Vend grumbullimi jo i duhur, për shembull, kur mblidhen tamponat orofaringeale, thellësia e grumbullimit nuk është e mjaftueshme, strishat e mbledhura nazofaringeale nuk mblidhen thellë në zgavrën e hundës, etj. Shumica e qelizave të mbledhura mund të jenë qeliza pa viruse;

② Tamponët e kampionimit janë përdorur gabimisht.Për shembull, për materialin e kokës së shtupës rekomandohen fibra sintetike si fibra PE, fibra poliester dhe fibra polipropileni.Fibrat natyrale si pambuku përdoren në funksionimin aktual (adsorbimi i fortë i proteinave dhe jo i lehtë për t'u larë) dhe fibrat najloni (thithja e dobët e ujit, që çon në volum të pamjaftueshëm të marrjes së mostrave);

③Përdorimi i gabuar i tubave të ruajtjes së virusit, si p.sh. keqpërdorimi i tubave të ruajtjes së polipropilenit ose polietileni plastike që absorbohen lehtë acidet nukleike (ADN/ARN), duke rezultuar në një ulje të përqendrimit të acidit nukleik në tretësirën e ruajtjes.Në praktikë, rekomandohet përdorimi i plastikës polimer polietileni-propilen dhe disa enë plastike polipropileni të trajtuara posaçërisht për të ruajtur acidet nukleike virale.]

(4) Puna laboratorike klinike nuk është e standardizuar.Kushtet e transportit dhe ruajtjes së mostrave, funksionimi i standardizuar i laboratorëve klinikë, interpretimi i rezultateve dhe kontrolli i cilësisë janë faktorët kryesorë për të siguruar saktësinë dhe besueshmërinë e rezultateve të testit.Sipas rezultateve të vlerësimit të jashtëm të cilësisë të kryer nga Qendra Klinike Laboratorike e Komisionit Kombëtar të Shëndetësisë në datat 16-24 Mars 2020, nga 844 laboratorë që kanë marrë rezultate të vlefshme, 701 (83,1%) janë kualifikuar dhe 143 (16,9%) jo.Të kualifikuar, kushtet e përgjithshme të testimit laboratorik janë të mira, por laboratorë të ndryshëm ende kanë dallime në aftësinë e operimit të personelit, aftësinë e interpretimit pozitiv të mostrës me një objektiv të vetëm dhe kontrollin e cilësisë.

Si të zvogëloni negativin e rremë të zbulimit të acidit nukleik SARS-CoV-2?

Reduktimi i negativëve të rremë në zbulimin e acidit nukleik duhet të optimizohet nga katër aspektet e prodhimit të negativëve të rremë.

(1) Ekziston një sasi e caktuar virusi në qelizat e personit të infektuar.Përqendrimi i virusit në pjesë të ndryshme të trupit të personave të dyshuar të infektuar do të jetë i ndryshëm në periudha të ndryshme.Nëse nuk ka faring, ai mund të jetë në lëngun e lavazhit bronkial ose në feces.Nëse disa lloje të mostrave mund të mblidhen në të njëjtën kohë ose në faza të ndryshme të përparimit të sëmundjes për testim, do të ndihmojë në shmangien e negativëve të rremë.

(2) Qelizat që përmbajnë virus duhet të mblidhen gjatë mbledhjes së mostrës.Ky problem mund të zgjidhet në masë të madhe duke forcuar trajnimin e grumbulluesve të mostrave.

(3) Reagentë të besueshëm IVD.Duke kryer kërkime mbi vlerësimin e performancës së zbulimit të reagentëve në nivel kombëtar dhe duke diskutuar problemet ekzistuese, efikasiteti i zbulimit të reagentëve mund të përmirësohet më tej dhe ndjeshmëria e analizës mund të përmirësohet.

(4) Funksionimi i standardizuar i laboratorëve klinikë.Duke forcuar trajnimin e personelit laboratorik, duke përmirësuar vazhdimisht sistemin e menaxhimit të cilësisë së laboratorit, duke siguruar ndarje të arsyeshme dhe duke përmirësuar aftësinë e personelit për të zbuluar, është e mundur të zvogëlohen negativët e rremë për shkak të operacioneve të gabuara laboratorike.

Arsyet për ri-testimin pozitiv të testit të acidit nukleik SARS-CoV-2 në pacientët e shëruar dhe të liruar

"Plani i Diagnostifikimit dhe Trajtimit i COVID-19 (Edicioni i Shtatë i Gjykimit)" përcakton qartë që një nga kriteret për pacientët COVID-19 që të shërohen dhe të shkarkohen nga spitali është se dy mostra të njëpasnjëshme të traktit të frymëmarrjes kanë një test negativ të acidit nukleik (të paktën 24 orë larg), por ka shumë pak SARS-COV-2 Test nukleik i acidit nukleik përsëri në mënyrë pozitive në distancën e acidit nuk do të vinin në provë të ndryshme.

(1)SARS-CoV-2 është një virus i ri.Është e nevojshme të kuptohet më tej mekanizmi i tij patogjen, tabloja e plotë e sëmundjes së shkaktuar dhe karakteristikat e rrjedhës së sëmundjes.Prandaj, nga njëra anë, është e nevojshme të forcohet menaxhimi i pacientëve të liruar dhe të kryhet vëzhgimi mjekësor 14-ditor.Kryerja e ndjekjes, monitorimit shëndetësor dhe udhëzimeve shëndetësore për të thelluar të kuptuarit e të gjithë procesit të shfaqjes, zhvillimit dhe rezultatit të sëmundjes.

(2) Pacienti mund të infektohet përsëri me virusin.Akademiku Zhong Nanshan tha: Për shkak se pacientët e kuruar kanë antitrupa, SARS-CoV-2 mund të eliminohet nga antitrupat kur ata pushtojnë përsëri.Ka shumë arsye, të cilat mund të jenë shkaku i pacientit të rikuperuar, ose mund të lidhen me mutacionin e virusit, apo edhe shkaku i testimit laboratorik.Nëse është vetë virusi, mutacioni SARS-CoV-2 mund të bëjë që antitrupi i prodhuar nga pacienti i rikuperuar të jetë joefektiv ndaj virusit të mutuar.Nëse pacienti infektohet sërish me virusin e mutuar, testi i acidit nukleik mund të jetë sërish pozitiv.

(3) Për sa i përket metodave të testimit laboratorik, çdo metodë testimi ka kufizimet e veta.Zbulimi i acidit nukleik SARS-CoV-2 është për shkak të zgjedhjes së sekuencës së gjeneve, përbërjes së reagentëve, ndjeshmërisë së metodës dhe arsyeve të tjera, duke çuar në faktin se kutitë ekzistuese kanë kufijtë e tyre më të ulët të zbulimit.Pasi pacienti trajtohet, virusi në trup zvogëlohet.Kur ngarkesa virale në kampionin që do të testohet është nën kufirin e poshtëm të zbulimit, do të shfaqet një rezultat "negativ".Megjithatë, ky rezultat nuk do të thotë që virusi në trup është zhdukur plotësisht.Virusi mund të jetë pas ndërprerjes së trajtimit.Ringjallje”, vazhdoni të kopjoni.Prandaj, rekomandohet rishikimi një herë në javë brenda 2 deri në 4 javë pas shkarkimit.

(4) Acidi nukleik është materiali gjenetik i virusit.Virusi vritet pasi pacienti i është nënshtruar trajtimit antiviral, por fragmentet e mbetura të ARN-së virale ruhen ende në trupin e njeriut dhe nuk shkarkohen plotësisht nga trupi.Ndonjëherë, në rrethana të caktuara, mund të ruhet më shumë.Për një kohë të gjatë dhe në këtë kohë testi i acidit nukleik do të jetë pozitiv "kalimtar".Me zgjatjen e kohës së rikuperimit të pacientit, pasi fragmentet e mbetura të ARN-së në trup janë shterur gradualisht, rezultati i testit të acidit nukleik mund të kthehet negativ.

(5) Rezultati i testit të acidit nukleik të SARS-CoV-2 vërteton vetëm praninë ose mungesën e ARN-së virale dhe nuk mund të vërtetojë aktivitetin e virusit dhe nëse virusi është i transmetueshëm.Është e nevojshme të vërtetohet nëse një pacient që ka sërish një test pozitiv të acidit nukleik do të bëhet sërish burim infeksioni.Është e nevojshme të kryhet kultura e virusit në mostrat klinike dhe të kultivohet një virus "i gjallë" për të vërtetuar se ai është infektiv.

Përmbledhje

Në përmbledhje, nuk mund të shmangen plotësisht testet e acidit nukleik SARS-CoV-2, negativë të rremë, teste pozitive të ritestimit dhe kushte të tjera që nuk janë në përputhje me manifestimet klinike.Në shqyrtimin dhe testimin aktual, rekomandohet të kombinohen simptomat klinike, ekzaminimet imazherike (CT) dhe eksperimentet Rezultatet e testit laboratorik (testi i acidit nukleik + testi i antitrupave specifik për virusin) për diagnozë gjithëpërfshirëse për të parandaluar diagnozën e humbur dhe diagnozën e gabuar.Nëse rezultatet e testit zbulohen qartësisht në mospërputhje me manifestimet klinike, rekomandohet të kryhet një analizë gjithëpërfshirëse e të gjithë lidhjes së testit (mbledhja e mostrave, qarkullimi dhe lidhjet e përpunimit) për të përjashtuar infeksionin e hershëm të virusit SARS-CoV-2, infeksionin e përsëritur ose të kombinuar me infeksione të tjera të virusit të frymëmarrjes, etj. të mundshme.Nëse kushtet e lejojnë, rekomandohet të mblidhen mostra më të ndjeshme si pështyma ose lëngu i lavazhit alveolar për riekzaminim.

Produkte të ngjashme:

Kompleti për zbulimin e acidit nukleik SARS-CoV-2 (Metoda e sondës fluoreshente PCR Multiplex)