Verifikimi i performancës së primerëve dhe sondave në fazën e hershme të reagentëve PCR dhe përcaktimi i kushteve më të përshtatshme të reagimit janë parakushtet për të siguruar ecurinë e qetë të eksperimenteve formale.
Pra, si duhet të konfirmojmë sondën e primerit në fazën e hershme?
Treguesit kryesorë janë vija bazë, kurba e amplifikimit, vlera ct, efikasiteti i amplifikimit, zbulimi i kampionit me përqendrim të ulët, CV, etj.
Baza bazë
Vija bazë është vija horizontale në kurbën e amplifikimit PCR.Në ciklet e para të reaksionit të amplifikimit PCR, sinjali i fluoreshencës nuk ndryshon shumë dhe formon një vijë të drejtë.Kjo vijë e drejtë është vija bazë.
Kur kontrolloni sondat e primerit PCR, kushtojini vëmendje nëse vija bazë është e nivelit.Pastërtia e përqendrimit të sondës së primerit do të ndikojë në vijën bazë, siç është shkaktimi i rritjes ose rënies së vijës bazë.Vija bazë është gjithashtu një tregues shumë intuitiv.
Kurba e përforcimit
Një tregues tjetër intuitiv është forma e kurbës së amplifikimit.Është mirë që të kemi një kurbë në formë S për të shmangur amplifikimin dytësor ose kurba të tjera jonormale të amplifikimit.
Vlera Ct
Numri i cikleve që korrespondojnë me pikën e lakimit nga vija bazë në rritjen eksponenciale është vlera Ct.
Për të njëjtin mostër, sonda të ndryshme primer rezultojnë në kthesa të ndryshme të amplifikimit dhe vlera përkatëse Ct do të ndikohet nga efikasiteti i amplifikimit dhe shkalla e ndërhyrjes.Në teori, sa më e vogël të jetë vlera Ct e sondës së primerit që zgjedhim, aq më mirë.
Efikasiteti i Amplifikimit
Një nga metodat më të besueshme dhe më të qëndrueshme për vlerësimin e efikasitetit të amplifikimit PCR është kurba standarde, e cila gjithashtu njihet gjerësisht nga studiuesit.Metoda përfshin krijimin e një serie mostrash për të kontrolluar numrin relativ të shablloneve të synuar.Këto mostra zakonisht bëhen me hollime serike të solucioneve të përqendruara, më e përdorura është hollimi 10-fish.Duke përdorur një seri mostrash të holluara, duke përdorur programin standard qPCR për të amplifikuar për të marrë vlerën Cq, dhe në fund vizatoni një kurbë standarde sipas përqendrimit të çdo kampioni dhe vlerës përkatëse të Cq për të marrë ekuacionin linear Cq= -klgX0+b, dhe efikasitetin e amplifikimit E=10(-1 /k)-1.Kur përdoret qPCR për analiza sasiore, efikasiteti i amplifikimit kërkohet të jetë në intervalin 90%-110% (3.6>k>3.1).
Zbulimi i mostrave me përqendrim të ulët
Kur përqendrimi i kampionit është i ulët, shpejtësitë e zbulimit të sondave të ndryshme të primerit janë të ndryshme.Ne zgjedhim 20 mostra me përqendrim të ulët për t'u përsëritur dhe sistemi i sondës së primerit me shkallën më të lartë të zbulimit është më i miri.
Koeficienti i variacionit (CV)
10 mostra dublikate mund të zbulohen me sonda të ndryshme primerësh sipas standardit të linjës së reagentit për zbulimin e amplifikimit të acidit nukleik.
Reagentët sasiorë:
Saktësia
Saktësia brenda një grupi duhet të plotësojë: koeficienti i variacionit (CV,%) i vlerës logaritmike të përqendrimit të testit është ≤5%.Kur përqendrimi i kampionit është i ulët, koeficienti i variacionit (CV,%) i logaritmit të përqendrimit të zbulimit është ≤10%
Reagentët cilësorë:
Saktësia
Saktësia brenda një grupi duhet të plotësojë:
(1) Koeficienti i variacionit të vlerës Ct (CV,%) ≤5%
I njëjti mostër testohet paralelisht 10 herë dhe rezultatet e testit duhet të jenë të qëndrueshme
Koha e postimit: Shtator-18-2021
