Unë besoj se të gjithë do të hasin gjithmonë probleme të tilla ose të tilla kur bëjnë reagime PCR, por shumica e tyre mund të klasifikohen në dy probleme kryesore:

Përforcim shumë i vogël i shabllonit të gjenit (amplifikimi);
Përforcim i tepërt i gjenit jo të synuar.
Përdorimi i aditivëve është një nga strategjitë e zakonshme për të zgjidhur këto probleme.Zakonisht roli i aditivëve ka dy aspekte:
strukturë dytësoretë gjeneve (struktura dytësore);
Zvogëloni mbushjen jo specifike.
Sot, redaktori do t'ju prezantojë shkurtimisht aditivët e zakonshëm në reaksionet PCR dhe funksionet e tyre.
Aditivë që reduktojnë strukturën dytësore
sulfoksid(DMSO)
mostrat e gjeneveme përmbajtje të lartë GC.Megjithatë, DMSO gjithashtu redukton në masë të madhe aktivitetin e polimerazës Taq.Prandaj, të gjithë duhet të balancojnë aksesin e shabllonit dhe aktivitetin e polimerazës.Redaktori sugjeron që mund të provoni përqendrime të ndryshme të DSMO, si nga 2% në 10%, për të gjetur përqendrimin që i përshtatet eksperimentit tuaj.
Detergjentë jojonikë
Detergjentët jo-jonikë, të tillë si Triton X-100 0,1-1%, Tween 20 ose NP-40, zakonisht reduktojnë strukturën dytësore të ADN-së.Megjithëse kjo mund të rrisë amplifikimin e gjenit shabllon, do të shkaktojë gjithashtu telashe të amplifikimit jospecifik.Pra, këta aditivë funksionojnë mirë për reaksionet PCR me rendiment të ulët pa mbeturina, por jo aq mirë për reaksionet PRC relativisht të papastër.Një përfitim tjetër i detergjenteve jojonike është reduktimi i ndotjes me SDS.Zakonisht gjatë procesit të nxjerrjes së ADN-së, SDS do të sillet në hapin PCR, i cili frenon shumë aktivitetin e polimerazës.Prandaj, shtimi i 0.5% Tween-20 ose Tween-40 në reagim mund të neutralizojë efektet negative të SDS.
Betaine_
Betaina mund të përmirësojë amplifikimin e ADN-së duke reduktuar formimin e strukturës dytësore dhe në përgjithësi është një shtesë "mister" për kompletet komerciale të PCR.Nëse dëshironi të përdorni betainë, duhet të vendosni betainë ose betainë monohidrat (Betaine ose Betaine monohidrat), por jo betainë hidroklorur (Betaine HCl), rregulloni në një përqendrim përfundimtar 1-1,7 M.Betaina mund të ndihmojë gjithashtu në përmirësimin e specifikës sepse eliminon varësinë e përbërjes së çiftit të bazës nga shkrirja e ADN-së / denatyrimi i ADN-së.
Aditivë për të reduktuar mbushjen jo specifike
Formamidi
Formamidi është një aditiv organik PCR i përdorur zakonisht.Mund të kombinohet me brazdë të madhe dhe të vogël në ADN, duke reduktuar kështu qëndrueshmërinë e spirales së dyfishtë të ADN-së kryesore dhe duke ulur temperaturën e shkrirjes së ADN-së.Përqendrimi i formamidit që përdoret në eksperimentet PCR është zakonisht 1%-5%.
Tetrametilklorur amoniumi( TMAC)
Kloridi tetrametilamoniumi mund të rrisë specifikën e hibridizimit (specifitetin e hibridizimit) dhe të rrisë temperaturën e shkrirjes së ADN-së.Kështu, TMAC mund të heqë priming jo-specifik dhe të zvogëlojë lidhjen e gabuar të ADN-së dhe ARN-së.Nëse përdorniabetare të degjeneruaranë reaksionin PCR, mos harroni të shtoni TMAC, i cili përdoret zakonisht në një përqendrim prej 15-100 mM.
Aditivë të tjerë të zakonshëm
Përveç dy kategorive të aditivëve të përmendur më sipër, ka shumë aditivë të zakonshëm në reaksionet PCR, megjithëse kanë funksione të ndryshme, ato janë gjithashtu shumë të rëndësishme.
Joni i magnezit
Joni i magnezit është një kofaktor (kofaktor) i domosdoshëm i polimerazës, domethënë, pa jonin e magnezit, polimeraza është joaktive.Megjithatë, shumë jone magnezi mund të ndikojnë gjithashtu në efikasitetin e polimerazës.Përqendrimi i joneve të magnezit në çdo reaksion PCR do të ndryshojë.Agjentët kelatues (të tillë si EDTA ose citrat), përqendrimi i dNTP-ve dhe proteinave të gjithë ndikojnë në përqendrimin e joneve të magnezit.Pra, nëse keni probleme me eksperimentin tuaj PCR, mund të përpiqeni të ndryshoni përqendrime të ndryshme të joneve të magnezit, për shembull, nga 1.0 në 4.0 mM, me një interval prej 0.5-1 mm në mes.
Vlen të përmendet se cikle të shumta ngrirje-shkrirje mund të çojnë në shtresimin e përqendrimit të tretësirës së klorurit të magnezit.Prandaj, duhet ta shpërndani plotësisht para çdo përdorimi dhe ta përzieni mirë përpara se ta përdorni.
Albumina e serumit të gjedhit(Albumina e gjedhit, BSA)
Në eksperimentet e kimisë molekulare, albumina e serumit të gjedhit është një aditiv shumë i zakonshëm, veçanërisht në eksperimentet e tretjes së enzimave kufizuese dhe PCR.Në reaksionet PCR, BSA është e dobishme në reduktimin e ndotësve të tillë si komponimet fenolike.Dhe thuhet gjithashtu se mund të zvogëlojë ngjitjen e reaktantëve në murin e epruvetës.Në reaksionin PCR, zakonisht përqendrimi i BSA i shtuar mund të arrijë 0.8 mg/ml.
 
Produkte të ngjashme:
Heroi i PCR(me bojë)
Heroi i PCR