Baza e projektimit të primerit (99% e problemeve mund të zgjidhen)
1. Gjatësia e abetares: Teksti shkollor kërkon 15-30 bp, zakonisht rreth 20 bp.Gjendja aktuale është më mirë të jetë 18-24 bp për të siguruar specifikën, por sa më gjatë, aq më mirë, abetarja shumë e gjatë gjithashtu do të zvogëlojë specifikën dhe do të zvogëlojë rendimentin.
2. Hapësira e amplifikimit të primerit: 200-500 bp është e përshtatshme dhe fragmenti mund të zgjerohet në 10 kb në kushte specifike.
3. Baza e primerit: Përmbajtja e G+C duhet të jetë 40-60%, shumë pak efekt amplifikues G+C nuk është i mirë, shumë G+C është e lehtë të shfaqen breza jo specifikë.ATGC shpërndahet më së miri në mënyrë të rastësishme, duke shmangur grupimet me më shumë se 5 nukleotide purine ose pirimidine.Multi-gc për fundin 5' dhe sekuencat e ndërmjetme për të rritur qëndrueshmërinë, shmangni GC të pasur në fundin 3', pa GC për 3 bazat e fundit ose pa GC për 3 nga 5 bazat e fundit.
4. Shmangni strukturën dytësore në abetare dhe shmangni komplementimin ndërmjet dy abetareve, veçanërisht komplementimin në fundin 3', përndryshe do të formohet dimeri i primerit dhe do të krijohen breza të përforcuar jo specifikë.
5. Bazat në fundin 3' të primerëve, veçanërisht bazat e fundit dhe të parafundit, duhet të çiftohen rreptësisht për të shmangur dështimin e PCR për shkak të bazave terminale të paçiftuara.
6. Primerët kanë ose mund të shtohen me vendet e duhura të ndarjes, dhe sekuenca e synuar e përforcuar preferohet të ketë vendet e duhura të ndarjes, gjë që është shumë e dobishme për analizën e ndarjes ose klonimin molekular.
7. Specifikimi i primerëve: primerët nuk duhet të kenë një homologji të dukshme me sekuencat e tjera në bazën e të dhënave të sekuencës së acidit nukleik.
8. Mësoni të përdorni softuerin: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Ky dizajn online funksionon më mirë).
Përmbajtja e mësipërme mund të zgjidhë të paktën 99% të problemeve të projektimit të primerit.
Kontrolloni detajet e dizajnit të primerit
1. Gjatësia e abetares
Gjatësia e përgjithshme e primerit është 18-30 baza.Në përgjithësi, faktori më i rëndësishëm që përcakton temperaturën e pjekjes së abetares është gjatësia e abetares.Temperatura e pjekjes së abetares zgjidhet përgjithësisht (vlera Tm -5℃), dhe disa përdorin drejtpërdrejt vlerën Tm.Formulat e mëposhtme mund të përdoren për të llogaritur përafërsisht temperaturën e pjekjes së abetareve.
Kur gjatësia e primerit është më e vogël se 20 bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Kur gjatësia e primerit është më e madhe se 20 bp: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/gjatësia-5℃
Përveç kësaj, shumë softuer mund të përdoren gjithashtu për të llogaritur temperaturën e pjekjes, parimi i llogaritjes do të jetë i ndryshëm, kështu që ndonjëherë vlera e llogaritur mund të ketë një hendek të vogël.Për të optimizuar reaksionet PCR, përdoren primerët më të shkurtër që sigurojnë temperatura pjekjeje jo më të vogla se 54℃ për efikasitetin dhe specifikën më të mirë.
Në përgjithësi, specifika e primerit rritet me një faktor prej katër për çdo nukleotid shtesë, kështu që gjatësia minimale e primerit për shumicën e aplikimeve është 18 nukleotide.Kufiri i sipërm i gjatësisë së abetares nuk është shumë i rëndësishëm, kryesisht i lidhur me efikasitetin e reaksionit.Për shkak të entropisë, sa më i gjatë të jetë abetarja, aq më e ulët është shkalla me të cilën ai përthithet për t'u lidhur me ADN-në e synuar për të formuar një shabllon të qëndrueshëm me dy zinxhirë për lidhjen e ADN polimerazës.
Kur përdorni softuer për të projektuar primerët, gjatësia e primerëve mund të përcaktohet nga vlera TM nga ana tjetër, veçanërisht për primerët e PCR sasiore fluoreshente, duhet të kontrollohet TM=60℃ ose më shumë.
2.Përmbajtja GC
Në përgjithësi, përmbajtja e G+C në sekuencat e primerit është 40%~60%, dhe përmbajtja GC dhe vlera Tm e një çifti primerësh duhet të koordinohen.Nëse primeri ka një tendencë serioze GC ose AT, sasia e duhur e bishtit A, T ose G dhe C mund të shtohet në fundin 5' të abetares.
3. Temperatura e pjekjes
Temperatura e pjekjes duhet të jetë 5℃ më e ulët se temperatura e shkëputjes së zinxhirit.Nëse numri i bazave të primerit është i vogël, temperatura e pjekjes mund të rritet siç duhet, gjë që mund të rrisë specifikën e PCR.Nëse numri i bazave është i madh, temperatura e pjekjes mund të reduktohet në mënyrë të përshtatshme.Diferenca e temperaturës së pjekjes midis një çifti abetaresh prej 4℃ ~ 6℃ nuk do të ndikojë në rendimentin e PCR, por në mënyrë ideale temperatura e pjekjes së një palë abetaresh është e njëjtë, e cila mund të ndryshojë midis 55℃ ~ 75℃.
4. Shmangni zonën e strukturës dytësore të shabllonit të amplifikimit
Është më mirë të shmangni rajonin e strukturës dytësore të shabllonit kur zgjidhni fragmentin e përforcuar.Struktura e qëndrueshme sekondare e fragmentit të synuar mund të parashikohet dhe vlerësohet nga softueri kompjuterik përkatës, i cili është i dobishëm për zgjedhjen e shabllonit.Rezultatet eksperimentale tregojnë se zgjerimi është shpesh i pasuksesshëm kur energjia e lirë (△G) e rajonit që do të zgjerohet është më pak se 58.6lkJ/mol.
5. Mospërputhja me ADN-në e synuar
Kur sekuenca e ADN-së e amplifikuar e synuar është e madhe, një primer mund të lidhet me pjesë të shumta të ADN-së së synuar, duke rezultuar në shfaqjen e brezave të shumtë në rezultat.Këtë herë është e nevojshme të përdorni testimin e softuerit BLAST, faqen e internetit:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Zgjidhni Align dy sekuenca (bl2seq).
Ngjitja e sekuencave të primerit në zonën 1 dhe sekuencave të synuara të ADN-së në zonën 2 është e këmbyeshme, dhe BLAST llogarit mundësi plotësuese, antisense dhe të tjera, kështu që përdoruesit nuk kanë nevojë të vërejnë nëse të dy zinxhirët janë zinxhirë sensualë.Ju gjithashtu mund të futni numrin GI nëse e dini numrin GI të sekuencës në bazën e të dhënave, kështu që nuk keni nevojë të ngjitni një seksion të madh të sekuencës.Së fundi, klikoni Align at 3 për të parë nëse primeri ka vende të shumta homologe në ADN-në e synuar.
6. Terminali i primerit
Fundi 3' i abetares është vendi ku fillon shtrirja, prandaj është e rëndësishme të parandaloni mospërputhjet që të fillojnë atje.Fundi 3' nuk duhet të jetë më shumë se 3 G ose C radhazi, sepse kjo do të bëjë që primeri të aktivizohet gabimisht në rajonin e sekuencës së pasurimit G+C.Fundi 3' nuk mund të formojë asnjë strukturë dytësore, përveçse në reaksionet speciale PCR (AS-PCR), fundi 3' i primerit nuk mund të mos përputhet.Për shembull, nëse rajoni kodues është i përforcuar, fundi 3' i primerit nuk duhet të përfundojë në pozicionin e tretë të kodonit, sepse pozicioni i tretë i kodonit është i prirur të degjenerohet, gjë që do të ndikojë në specifikën dhe efikasitetin e amplifikimit.Kur përdorni primerë aneksues, referojuni tabelës së përdorimit të kodoneve, kushtojini vëmendje preferencës biologjike, mos përdorni primerë aneksues në fundin 3' dhe përdorni një përqendrim më të lartë të abetareve (1uM-3uM).
7. Struktura dytësore e abetareve
Vetë abetaret nuk duhet të kenë sekuenca plotësuese, përndryshe vetë abetaret do të palosen në struktura me kapëse flokësh dhe kjo strukturë dytësore do të ndikojë në lidhjen e abetareve dhe shablloneve për shkak të pengesës sterike.Nëse përdoret gjykimi artificial, bazat e vazhdueshme plotësuese të vetë abetareve nuk duhet të jenë më të mëdha se 3 bp.Nuk duhet të ketë komplementaritet midis dy abetareve, veçanërisht duhet të shmanget mbivendosja plotësuese e skajit 3' për të parandaluar formimin e dimerëve të primerit.Në përgjithësi, nuk duhet të ketë më shumë se 4 homologji ose komplementaritet bazash të njëpasnjëshme midis një çifti abetaresh.
8. Shtoni shënues ose lokacione
Fundi 5 ka pak efekt në specifikën e amplifikimit dhe për këtë arsye mund të modifikohet pa ndikuar në specifikën e amplifikimit.Modifikimi i fundit të primerit 5 përfshinte: shtimin e vendit të kufizimit të enzimës;Biotina e etiketuar, fluoreshenca, digoksina, Eu3+, etj. Prezantoni sekuencat e ADN-së që lidhin proteinat;Futja e vendeve të mutacionit, futja dhe mungesa e sekuencave të mutacioneve dhe futja e sekuencave promotore, etj. Bazat shtesë do të ndikojnë pak a shumë në efikasitetin e amplifikimit dhe do të rrisin mundësinë e formimit të dimerit të primerit, por duhen bërë disa lëshime për hapin tjetër.Sekuenca shtesë që nuk ekzistojnë në sekuencën e synuar, të tilla si vendet kufizuese dhe sekuencat e promotorit, mund të shtohen në fundin 5' të primerit pa ndikuar në specifikën.Këto sekuenca nuk përfshihen në llogaritjen e vlerave Tm të primerit, por duhet të testohen për komplementaritet dhe strukturë të brendshme dytësore.
9. Nënklonet
Në shumicën e rasteve, PCR është vetëm klonim paraprak, dhe më pas ne duhet të nënklonojmë fragmentin e synuar në vektorë të ndryshëm, kështu që duhet të hartojmë baza shtesë për operacionin e ardhshëm në hapin PCR.
Disa sekuenca të dizajnuara për nënklonim janë përmbledhur më poshtë.
Vendi i kufizimit të endonukleazës së kufizimit u shtua
Shtimi i vendeve të kufizimit të enzimës është metoda më e përdorur për nënklonimin e produkteve PCR.Në përgjithësi, vendi i ndarjes është gjashtë baza, përveç 5 'fundit të faqes së ndarjes duhet të shtoni 2 ~ 3 baza mbrojtëse.Megjithatë, numri i bazave mbrojtëse të kërkuara nga enzima të ndryshme është i ndryshëm.Për shembull, SalⅠ nuk kërkon bazë mbrojtëse, EcoRⅤ kërkon 1 bazë mbrojtëse, NotⅠ kërkon 2 baza mbrojtëse dhe Hind Ⅲ kërkon 3 baza mbrojtëse.
LIC shton bishtin
Emri i plotë i LIC është klonimi i pavarur nga Ligation, një metodë klonimi e shpikur nga Navogen posaçërisht për pjesën e saj të vektorit pET.Transportuesi pET i përgatitur me metodën LIC ka skaje ngjitëse jo plotësuese 12-15 bazë, të cilat plotësojnë skajet ngjitëse përkatëse në fragmentin e futur të synuar.Për qëllime amplifikimi, sekuenca e primerit 5' e fragmentit të futur duhet të plotësojë vektorin LIC.Aktiviteti 3'→5' i jashtëm i polimerazës T4 të ADN-së mund të formojë një fund ngjitës të vetëm në fragmentin e futur pas një kohe të shkurtër.Për shkak se produkti mund të formohet vetëm nga pjekja e ndërsjellë e fragmentit të futur të përgatitur dhe vektorit, kjo metodë është shumë e shpejtë dhe efikase dhe është klonimi i drejtuar.
Klon TA i drejtuar shtoj bisht
Klonimi TA nuk ishte në gjendje të synonte fragmentin në një vektor, kështu që më vonë Invitrogen prezantoi një vektor që mund të synonte klonimin, i cili përmbante katër bazë të spikatur GTGGS në njërin skaj.Prandaj, në hartimin e primerëve PCR, duhet të shtohen sekuenca plotësuese në përputhje me rrethanat, në mënyrë që fragmentet të mund të "orientohen".
Nëse nuk keni kohë, mund të provoni sintezën e drejtpërdrejtë, duke kombinuar gjenin me vektorin, që është ajo që ne e quajmë sintezë të gjenit ET tek muzekularistët.
D. Metoda e klonimit In-Fusion
Nuk kërkohet ligazë, nuk kërkohet reagim i gjatë.Përderisa futet një sekuencë në të dy skajet e vektorit të linearizuar Në hartimin e abetareve, atëherë produkti PCR dhe vektori i linearizuar shtohen në tretësirën e enzimës me infuzion që përmban BSA dhe vendosen në temperaturën e dhomës për gjysmë ore, transformimi mund të kryhet.Kjo metodë është veçanërisht e përshtatshme për konvertimin e vëllimit të madh.
10. Merge abetare
Ndonjëherë, dihet vetëm informacion i kufizuar i sekuencës për dizajnin e primerit.Për shembull, nëse dihet vetëm sekuenca e aminoacideve, mund të dizajnohet abetarja e bashkimit.Një primer bashkimi është një përzierje e sekuencave të ndryshme që përfaqësojnë të gjitha mundësitë e ndryshme të bazës që kodojnë një aminoacid të vetëm.Për të rritur specifikën, mund t'i referoheni tabelës së përdorimit të kodonit për të reduktuar aneksimin sipas preferencave të përdorimit bazë të organizmave të ndryshëm.Hipoksantina mund të çiftohet me të gjitha bazat për të ulur temperaturën e pjekjes së primerit.Mos përdorni bazat e aneksuara në fundin 3′ të primerit sepse pjekja e 3 bazave të fundit në fundin 3′ është e mjaftueshme për të filluar PCR në vendin e gabuar.Përqendrimet më të larta të primerit (1μM deri në 3μM) përdoren sepse abetaret në shumë përzierje aneksuese nuk janë specifike për shabllonin e synuar.
Lëndët e para PCRkontrollin
1. Sasia e abetares
Përqendrimi i secilit primer është 0.1 ~ 1umol ose 10 ~ 100pmol.Është më mirë të prodhoni rezultatin e kërkuar me sasinë më të ulët të primerit.Përqendrimi i lartë i primerit do të shkaktojë mospërputhje dhe përforcim jospecifik dhe do të rrisë mundësinë e formimit të dimerëve midis primerëve.
2. Përqendrimi i abetares
Përqendrimi i abetareve ndikon në specifikën.Përqendrimi optimal i primerit është përgjithësisht midis 0,1 dhe 0,5 μM.Përqendrimet më të larta të primerit çojnë në amplifikimin e produkteve jospecifike.
3. Temperatura e pjekjes së abetares
Një tjetër parametër i rëndësishëm për abetaret është temperatura e shkrirjes (Tm).Kjo është temperatura kur 50% e primerëve dhe sekuencave plotësuese përfaqësohen si molekula të ADN-së me dy fije.Tm kërkohet për të vendosur temperaturën e pjekjes PCR.Në mënyrë ideale, temperatura e pjekjes është mjaft e ulët për të siguruar pjekjen efektive të primerëve me sekuencën e synuar, por mjaft e lartë për të reduktuar lidhjen jospecifike.Temperatura e arsyeshme e pjekjes nga 55℃ në 70℃.Temperatura e pjekjes zakonisht vendoset 5℃ më e ulët se Tm e abetares.
Ka disa formula për vendosjen e Tm, të cilat ndryshojnë shumë në varësi të formulës së përdorur dhe sekuencës së abetareve.Për shkak se shumica e formulave ofrojnë një vlerë të vlerësuar Tm, të gjitha temperaturat e pjekjes janë vetëm një pikënisje.Specifikimi mund të përmirësohet duke analizuar disa reagime që rrisin në mënyrë progresive temperaturën e pjekjes.Filloni nën Tm-5℃ të vlerësuar dhe rriteni gradualisht temperaturën e pjekjes me një rritje prej 2℃.Temperatura më e lartë e pjekjes do të zvogëlojë formimin e dimerëve të primerit dhe produkteve jo specifike.Për rezultate më të mira, dy primerët duhet të kenë vlera të përafërta Tm.Nëse diferenca Tm e çifteve të primerëve është më shumë se 5℃, primerët do të tregojnë një fillim të rremë domethënës duke përdorur një temperaturë më të ulët pjekjeje në cikël.Nëse dy primerët Tm janë të ndryshëm, vendosni temperaturën e pjekjes në 5℃ më të ulët se Tm më e ulët.Përndryshe, për të rritur specifikën, pesë cikle mund të kryhen së pari në temperatura pjekjeje të dizajnuara për Tm më të lartë, të ndjekura nga ciklet e mbetura në temperatura pjekjeje të dizajnuara për Tm më të ulët.Kjo lejon që një kopje e pjesshme e shabllonit të destinacionit të merret në kushte të vështira.
4. Pastërtia dhe qëndrueshmëria e abetares
Pastërtia standarde e primerëve me porosi është adekuate për shumicën e aplikacioneve PCR.Heqja e grupeve benzoil dhe izobutilil me shkripëzimin është minimale dhe për këtë arsye nuk ndërhyn në PCR.Disa aplikacione kërkojnë pastrim për të hequr çdo sekuencë jo të plotë në procesin e sintezës.Këto sekuenca të cunguara ndodhin sepse efikasiteti i kimisë së sintezës së ADN-së nuk është 100%.Ky është një proces rrethor që përdor reaksione kimike të përsëritura ndërsa secila bazë shtohet për të bërë ADN nga 3' në 5'.Ju mund të dështoni në secilin cikël.Primerët më të gjatë, veçanërisht ato më të mëdha se 50 baza, kanë një përqindje të madhe sekuencash të cunguara dhe mund të kërkojnë pastrim.
Rendimenti i abetareve ndikohet nga efikasiteti i kimisë sintetike dhe metoda e pastrimit.Kompanitë biofarmaceutike, si Citologjia dhe Shengong, përdorin të gjitha një njësi minimale OD për të siguruar prodhimin total të oligonukleozidit.Abetaret e personalizuara dërgohen në formë pluhuri të thatë.Është mirë që abetaret të rishpërndahen në TE në mënyrë që përqendrimi përfundimtar të jetë 100μM.TE është më i mirë se uji i dejonizuar sepse pH i ujit është shpesh acid dhe do të shkaktojë hidrolizën e oligonukleozideve.
Stabiliteti i abetareve varet nga kushtet e ruajtjes.Pluhuri i thatë dhe abetaret e tretura duhet të ruhen në -20℃.Primerët e tretur në TE në përqendrime më të mëdha se 10μM mund të ruhen në mënyrë të qëndrueshme në -20℃ për 6 muaj, por mund të ruhen vetëm në temperaturën e dhomës (15℃ deri në 30℃) për më pak se 1 javë.Primerët me pluhur të thatë mund të ruhen në -20 C për të paktën 1 vit dhe në temperaturën e dhomës (15 C deri në 30 C) deri në 2 muaj.
5. Enzimat dhe përqendrimet e tyre
Aktualisht, polimeraza e Taq DNA e përdorur është në thelb enzima e inxhinierisë së gjeneve e sintetizuar nga bakteret koliforme.Sasia e enzimës që nevojitet për të katalizuar një reaksion tipik PCR është rreth 2.5 U (i referohet vëllimit total të reaksionit prej 100 ul).Nëse përqendrimi është shumë i lartë, mund të çojë në përforcim jo specifik;nëse përqendrimi është shumë i ulët, sasia e produktit sintetik do të reduktohet.
6. Cilësia dhe përqendrimi i dNTP
Cilësia e dNTP është e lidhur ngushtë me përqendrimin dhe efikasitetin e amplifikimit PCR.Pluhuri dNTP është i grimcuar dhe ndryshueshmëria e tij humbet aktivitetin e tij biologjik nëse ruhet në mënyrë jo të duhur.Zgjidhja dNTP është acid dhe duhet të përdoret në përqendrim të lartë, me 1M NaOH ose 1M Tris.HCL zgjidhje tampon për të rregulluar PH-në e saj në 7.0 ~ 7.5, sasi e vogël nën-paketimi, magazinimi i ngrirë në -20℃.Ngrirja-shkrirja e shumëfishtë do të degradojë dNTP.Në reaksionin PCR, dNTP duhet të jetë 50 ~ 200umol/L.Veçanërisht, duhet t'i kushtohet vëmendje përqendrimit të katër DNTPS duhet të jetë i barabartë (përgatitja e barabartë e moleve).Nëse përqendrimi i ndonjërit prej tyre është i ndryshëm nga të tjerët (më i lartë ose më i ulët), do të shkaktohet mospërputhje.Përqendrimi shumë i ulët do të zvogëlojë rendimentin e produkteve PCR.dNTP mund të kombinohet me Mg2+ dhe të zvogëlojë përqendrimin e Mg2+ të lirë.
7. Modeli (gjeni i synuar) acidi nukleik
Sasia dhe shkalla e pastrimit të acidit nukleik të shabllonit është një nga lidhjet kryesore për suksesin ose dështimin e PCR.Metodat tradicionale të pastrimit të ADN-së zakonisht përdorin SDS dhe proteazën K për të tretur dhe asgjësuar ekzemplarët.Funksionet kryesore të SDS janë: shpërndan lipidet dhe proteinat në membranën qelizore, duke shkatërruar kështu membranën qelizore duke tretur proteinat e membranës dhe shpërbërjen e proteinave bërthamore në qelizë, SDS gjithashtu mund të kombinohet me proteinat dhe të precipitojë;Proteaza K mund të hidrolizojë dhe tresë proteinat, veçanërisht histonet e lidhura me ADN-në, dhe më pas të përdorë tretës organik fenol dhe kloroform për të nxjerrë proteina dhe përbërës të tjerë qelizor, dhe të përdorë etanol ose alkool izopropil për të precipituar acidin nukleik.Acidi nukleik i nxjerrë mund të përdoret si shabllon për reaksionet PCR.Për ekzemplarët e përgjithshëm të zbulimit klinik, mund të përdoret një metodë e shpejtë dhe e thjeshtë për të shpërndarë qelizat, për të lizuar patogjenët, për të tretur dhe hequr proteinat nga kromozomet në gjenet e lira të synuara dhe mund të përdoret drejtpërdrejt për amplifikimin e PCR.Ekstraktimi i shabllonit të ARN-së zakonisht përdor metodën e izotiocianatit të guanidinës ose të proteazës K për të parandaluar që RNase të degradojë ARN-në.
Përqendrimi 8.Mg2+
Mg2+ ka një efekt të rëndësishëm në specifikën dhe rendimentin e amplifikimit të PCR.Në reagimin e përgjithshëm PCR, kur përqendrimi i dNTP-ve të ndryshëm është 200umol/L, përqendrimi i duhur i Mg2+ është 1,5 ~ 2,0 mmol/L.Përqendrimi i Mg2+ është shumë i lartë, specifika e reagimit zvogëlohet, ndodh amplifikimi jo specifik, përqendrimi shumë i ulët do të zvogëlojë aktivitetin e polimerazës së ADN-së Taq, duke rezultuar në reduktimin e produkteve të reagimit.
Jonet e magnezit ndikojnë në disa aspekte të PCR, siç është aktiviteti i polimerazës së ADN-së, i cili ndikon në rendimentin;Një shembull tjetër është pjekja e primerit, e cila ndikon në specifikat.dNTP dhe shabllon lidhen me jonin e magnezit, duke reduktuar sasinë e jonit të lirë të magnezit të kërkuar për aktivitetin e enzimës.Përqendrimi optimal i joneve të magnezit ndryshon për çifte dhe shabllone të ndryshme primerësh, por një përqendrim tipik fillestar i PCR me 200μM dNTP është 1.5mM (shënim: Për PCR sasiore në kohë reale, përdorni 3 deri në 5mM tretësirë të joneve të magnezit me një sondë fluoreshente).Përqendrimet më të larta të joneve të magnezit të lirë rrisin rendimentin, por gjithashtu rrisin amplifikimin jospecifik dhe ulin besnikërinë.Për të përcaktuar përqendrimin optimal, titrat e joneve të magnezit u kryen në rritje prej 0.5mM nga 1mM në 3mM.Për të reduktuar varësinë nga optimizimi i joneve të magnezit, mund të përdoret Platinum Taq ADN polimeraza.Platinum Taq ADN polimeraza është në gjendje të ruajë funksionin në një gamë më të gjerë të përqendrimeve të joneve të magnezit sesa Taq ADN polimeraza dhe për këtë arsye kërkon më pak optimizim.
9. Aditivë që promovojnë Pcr
Optimizimi i temperaturës së pjekjes, dizajnit të primerit dhe përqendrimit të joneve të magnezit është i mjaftueshëm për amplifikimin shumë specifik të shumicës së shablloneve;megjithatë, disa shabllone, duke përfshirë ato me përmbajtje të lartë GC, kërkojnë masa shtesë.Aditivët që ndikojnë në temperaturën e shkrirjes së ADN-së ofrojnë një mënyrë tjetër për të përmirësuar specifikën dhe rendimentin e produktit.Kërkohet denatyrim i plotë i shabllonit për rezultate më të mira.
Përveç kësaj, struktura dytësore parandalon lidhjen e primerit dhe zgjerimin e enzimës.
Aditivët PCR, duke përfshirë formamidin, DMSO, glicerinë, betainë dhe tretësirë përmirësuese PCRx, përmirësojnë amplifikimin.Mekanizmi i tyre i mundshëm është të zvogëlojnë temperaturën e shkrirjes, duke ndihmuar kështu pjekjen e abetareve dhe duke ndihmuar shtrirjen e polimerazës së ADN-së përmes rajonit të strukturës dytësore.Zgjidhja PCRx ka avantazhe të tjera.Kërkohet optimizim minimal i joneve të magnezit kur përdoret me polimerazën Platinum Taq ADN dhe Platinum Pfx ADN polimerazën.Kështu, teknika e Platinumit kombinohet me aditivin për të rritur specifikën duke reduktuar varësinë e qasjes së tretë, optimizimin e joneve të magnezit.Për rezultate më të mira, përqendrimi i aditivëve duhet të optimizohet, veçanërisht DMSO, formamidi dhe glicerina, të cilat frenojnë Taq ADN polimerazën.
10. Fillimi i nxehtë
PCR e fillimit të nxehtë është një nga metodat më të rëndësishme për të përmirësuar specifikën e PCR përveç dizajnit të mirë të primerit.Megjithëse temperatura optimale e zgjatjes së Taq ADN polimerazës është 72℃, polimeraza mbetet aktive në temperaturën e dhomës.Kështu, produktet jo specifike prodhohen kur temperatura e mbajtjes është më e ulët se temperatura e pjekjes gjatë përgatitjes së reaksionit PCR dhe në fillim të ciklit termik.Pasi të formohen, këto produkte jo specifike përforcohen në mënyrë efektive.PCR e fillimit të nxehtë është veçanërisht efektive kur vendet e përdorura për projektimin e primerit janë të kufizuara nga vendndodhja e elementeve gjenetike, të tilla si mutacionet e drejtuara nga vendi, klonimi i shprehjes ose ndërtimi dhe manipulimi i elementeve gjenetike të përdorura për inxhinierinë e ADN-së.
Një metodë e zakonshme për të kufizuar aktivitetin e Taq ADN polimerazës është përgatitja e tretësirës së reaksionit PCR në akull dhe vendosja e saj në një aparat PCR të parangrohur.Kjo metodë është e thjeshtë dhe e lirë, por nuk përfundon aktivitetin e enzimës dhe për këtë arsye nuk eliminon plotësisht amplifikimin e produkteve jo specifike.
Priming termik vonon sintezën e ADN-së duke frenuar një komponent thelbësor derisa aparati PCR të arrijë temperaturën e denatyrimit.Shumica e metodave të inicimit termik manual, duke përfshirë shtimin e vonuar të polimerazës së ADN-së Taq, janë të vështira, veçanërisht për aplikimet me fuqi të lartë.Metodat e tjera të mbushjes termike përdorin një mburojë dylli për të mbyllur një komponent thelbësor, duke përfshirë jonet ose enzimat e magnezit, ose për të izoluar fizikisht përbërës reaktivë, të tillë si shabllonet dhe tamponët.Gjatë ciklit termik, përbërësit e ndryshëm lirohen dhe përzihen së bashku ndërsa dylli shkrihet.Ashtu si metoda e nisjes së nxehtë manuale, metoda e mburojës së dyllit është e rëndë dhe e prirur ndaj ndotjes dhe nuk është e përshtatshme për aplikime me kapacitet të lartë.
Polimeraza e ADN-së së platinit është e përshtatshme dhe efikase për PCR-në e ndezjes automatike.Platinum Taq ADN polimeraza përbëhet nga Taq ADN polimerazë rekombinante e kombinuar me antitrup monoklonal kundër Taq ADN polimerazës.Antitrupat formulohen me PCR për të penguar aktivitetin e enzimës gjatë mbajtjes së zgjatur të temperaturës.Taq ADN polimeraza u lëshua në reagim gjatë izolimit 94℃ të hapit të denatyrimit, duke rivendosur aktivitetin e plotë të polimerazës.Ndryshe nga polimeraza e modifikuar kimikisht Taq ADN për fillimin termik, enzima e platinit nuk kërkon izolim të zgjatur në 94℃ (10 deri në 15 minuta) për të aktivizuar polimerazën.Me PlatinumTaq ADN polimerazën, 90% e aktivitetit të Taq ADN polimerazës u rivendos pas 2 minutash në 94℃.
11. Nest-PCR
Raundet e njëpasnjëshme të amplifikimit duke përdorur primerë të mbivendosur mund të përmirësojnë specifikën dhe ndjeshmërinë.Raundi i parë është një përforcim standard prej 15 deri në 20 cikle.Një pjesë e vogël e produktit fillestar të amplifikimit u hollua 100 deri në 1000 herë dhe u shtua në raundin e dytë të amplifikimit për 15 deri në 20 cikle.Përndryshe, produkti fillestar i përforcuar mund të përmasohet nga pastrimi me xhel.Në raundin e dytë të amplifikimit përdoret një primer i vendosur, i cili mund të lidhet me sekuencën e synuar brenda primerit të parë.Përdorimi i PCR-së së vendosur zvogëlon mundësinë e amplifikimit të vendeve të shumta të synuara, sepse ka pak sekuenca objektive që plotësojnë të dy grupet e primerëve.I njëjti numër i përgjithshëm i cikleve (30 deri në 40) me të njëjtat primerë përforcoi vendet jospecifike.Nested PCR rrit ndjeshmërinë e sekuencave të synuara të kufizuara (p.sh., mrnas të rralla) dhe përmirëson specifikën e PCRS të vështirë (p.sh. RACE 5').
12. PCR zbritëse
PCR zbritëse përmirëson specifikën duke përdorur kushte të ngushta pjekjeje për ciklet e para të PCR.Cikli fillon në një temperaturë pjekjeje afërsisht 5℃ më e lartë se Tm e vlerësuar, më pas çdo cikël reduktohet me 1℃ në 2℃ derisa temperatura e pjekjes të jetë nën Tm 5℃.Vetëm shablloni i destinacionit me homologjinë më të lartë do të përforcohet.Këto produkte vazhdojnë të zgjerohen në ciklet e mëvonshme, duke lënë jashtë produktet jospecifike të përforcuara.PCR zbritëse është e dobishme për metodat ku shkalla e homologjisë midis primerit dhe shabllonit të synuar nuk dihet, si p.sh. gjurmët e gishtërinjve të ADN-së AFLP.
Komplete të lidhura PCR
Heroi 2× PCRTMSistemi Mix ka tolerancë më të lartë ndaj frenuesve PCR sesa sistemi i zakonshëm PCR Mix dhe mund të përballojë lehtësisht amplifikimin PCR të shablloneve të ndryshëm kompleks.Sistemi unik i reagimit dhe Taq Hero me efikasitet të lartë bëjnë që reaksioni PCR të ketë efikasitet, specifikë dhe ndjeshmëri më të lartë të amplifikimit.
Efikasitet më i lartë i amplifikimit
Ka aktivitet 5'→3' ADN polimerazë dhe 5'→3' aktivitet ekzonukleazë, pa aktivitet ekzonukleazë 3'→5'.
Paketa Easyᵀᴹ-SYBR Green I PCR në kohë reale
Tampon specifik - i optimizuar dhe enzima Taq me fillim të nxehtë mund të parandalojë amplifikimin jospecifik dhe formimin e dimerit të primerit
Ndjeshmëri e lartë—mund të zbulojë kopje të ulëta të shabllonit
Kompleti përdor një reagent unik të transkriptimit të kundërt Foregene dhe Foregene HotStar Taq ADN Polymerase të kombinuar me një sistem unik reagimi për të përmirësuar në mënyrë efektive efikasitetin e amplifikimit dhe specifikën e reaksionit.
Koha e postimit: Maj-09-2023
