PCR direkte është një reaksion që përdor drejtpërdrejt indet e kafshëve ose bimëve për amplifikimin pa ekstraktim të acidit nukleik.Në shumë mënyra, PCR e drejtpërdrejtë funksionon si PCR e zakonshme

Dallimi kryesor është tamponi i personalizuar i përdorur në PCR direkte, kampioni mund t'i nënshtrohet drejtpërdrejt reagimit PCR pa ekstraktim të acidit nukleik, por ka kërkesa përkatëse për tolerancën e enzimave dhe përputhshmërinë e tamponit të përfshirë në reagimin e drejtpërdrejtë PCR.

Edhe pse ka pak a shumë frenues PCR në mostrat e zakonshme, PCR direkte mund të arrijë akoma një amplifikim të besueshëm nën veprimin e enzimave dhe tamponëve.Reaksioni tradicional PCR kërkon acid nukleik me cilësi të lartë si shabllon, i cili mund të pengojë përparimin e qetë të reaksionit PCR nëse shablloni përmban proteina dhe papastërti të tjera.Direct PCR është aktualisht një nga teknologjitë më të njohura në fushën e diagnostikimit molekular.

01 Direct PCR fillimisht u përdor për kafshë dhe bimë

Aplikimi më i hershëm i PCR-së direkte është në fushën e kafshëve dhe bimëve, si gjaku, indet dhe qimet e miut, maces, pulës, lepurit, deleve, gjedhëve, etj., gjetheve dhe farave të bimëve, etj., të përdorura për të studiuar gjenotipizimin, transgjenik, zbulimin e plazmideve, analizën e identifikimit të gjeneve, analizën e burimit të ADN-së, identifikimin e burimeve të ADN-së dhe identifikimin e specieve të tjera në fushëN.

Këto fusha kanë disa veçori të përbashkëta, domethënë, përmbajtja e gjenit të synuar është relativisht e lartë dhe nxjerrja e acidit nukleik është e mundimshme, kështu që PCR e drejtpërdrejtë jo vetëm që mund të kursejë kohë dhe të ketë një ndikim të vogël në rezultate, por edhe të kursejë koston.

PCR e drejtpërdrejtë e përdorur për zbulimin e patogjenit është një çështje e viteve të fundit, disa prodhues të reagentëve PCR kanë bërë shumë përpjekje në këtë drejtim kur bëjnë risi.Sidomos në këtë epidemi të COVID-19, shumë produkte të tilla zbulimi janë shfaqur në treg, të tilla si SARS-CoV-2 Detection Acid Nukleic Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) i hulumtuar dhe zhvilluar nga Foregene, i cili përdor teknologjinë RT PCR në kohë reale (rRT-PCR) për zbulimin cilësor të acidit nukleik nazofal ose SARS-CoV-2. mostra të shtupës.

Foregene është një nga kompanitë që përdor teknologjinë Direct PCR, për zbulimin e ORF1ab, N, E, dhe normale.variant linjat e acideve nukleike në mostrat e shtupës nazofaringeale ose orofaringeale të njeriut, si p.sh. SARS-CoV-2 B.1.1.7 prejardhja (MB), linja B.1.351 (ZA), linja B.1.617 (IND) dhe linja P.1 (BR).

02  Reagentët e nevojshëm për PCR të drejtpërdrejtë

Mostra e Lizatës

Mostra e lizatit mund të konfigurohet vetë ose të blihet.Dallimi në përbërjen e markave të ndryshme të lizatit do ta bëjë aftësinë e lizimit të ndryshme, dhe më pas koha e lizimit do të jetë paksa e ndryshme.Për shembull, për përgatitjen e mostrave të indeve të kafshëve, rekomandohet përgjithësisht liza 30 minuta ose gjatë natës, dhe tretësira e lizës për viruset varion nga 3-10 minuta.

Master mix PCR

Rekomandohet të përdoret polimeraza e ADN-së me fillim të nxehtë për të përmirësuar amplifikimin specifik dhe për të rritur aftësinë përforcuese.Bërthama e PCR direkte është një polimerazë shumë tolerante.

Eliminoni ose frenoni komponentët në mostër që ndikojnë në amplifikimin e ADN-së

Pasi kampioni të përpunohet me lizatin, proteinat, lipidet dhe mbeturinat e tjera qelizore do të çlirohen, këto substanca do të pengojnë reaksionin PCR.Prandaj, PCR direkte kërkon shtimin e heqjes ose frenuesve përkatës për të zvogëluar ndikimin e këtyre faktorëve.

03  Një koleksion i pesë pikave të njohurive të PCR direkte

Së pari, teknologjia Direct PCR është një teknologji e drejtpërdrejtë PCR për mostra të ndryshme biologjike.Në këtë gjendje teknike, nuk ka nevojë të ndahet dhe të nxirret acidi nukleik, të përdoret drejtpërdrejt mostra e indeve si objekt dhe të shtohen primerët e gjenit të synuar për të kryer reaksionin PCR.

Së dyti, teknologjia e drejtpërdrejtë PCR nuk është vetëm një teknologji tradicionale e amplifikimit të shabllonit të ADN-së, por përfshin gjithashtu PCR të transkriptimit të kundërt të shabllonit të ARN-së.

Së treti, teknologjia e drejtpërdrejtë PCR jo vetëm që kryen drejtpërdrejt reaksione cilësore rutinë të PCR në mostrat e indeve, por gjithashtu përfshin reaksione qPCR në kohë reale, gjë që kërkon që sistemi i reagimit të ketë aftësi të fuqishme të ndërhyrjes së fluoreshencës kundër sfondit dhe fluoreshenca endogjene shuan aftësinë antagoniste.

Së katërti, mostrat e synuara nga teknologjia Direct PCR kanë nevojë vetëm për lëshimin e shablloneve të acidit nukleik dhe nuk heqin proteinat, polisaharidet, jonet e kripës etj. që ndërhyjnë në reaksionin PCR.Kjo kërkon që polimeraza e acidit nukleik dhe PCR Mix në sistemin e reagimit të kenë rezistencë dhe përshtatshmëri të shkëlqyer për të siguruar aktivitetin e enzimës dhe saktësinë e replikimit në kushte komplekse.

Së pesti, kampioni i indit i synuar nga teknologjia Direct PCR pa asnjë trajtim të pasurimit të acidit nukleik dhe sasia e shabllonit është shumë e vogël, gjë që kërkon që sistemi i reagimit të ketë ndjeshmëri dhe efikasitet jashtëzakonisht të lartë të amplifikimit.