Teknologjia e diagnostikimit molekular përdor metoda të biologjisë molekulare për të zbuluar shprehjen dhe strukturën e materialit gjenetik të trupit të njeriut dhe patogjenëve të ndryshëm, në mënyrë që të arrihet qëllimi i parashikimit dhe diagnostikimit të sëmundjeve.

Vitet e fundit, me përmirësimin dhe përsëritjen e teknologjisë së diagnostikimit molekular, aplikimi klinik i diagnostikimit molekular është bërë gjithnjë e më i gjerë dhe më i thelluar, dhe tregu i diagnostikimit molekular ka hyrë në një periudhë zhvillimi të shpejtë.

Autori përmbledh teknologjitë e zakonshme të diagnostikimit molekular në treg dhe ndahet në tre pjesë: pjesa e parë prezanton teknologjinë PCR, pjesa e dytë prezanton teknologjinë e amplifikimit izotermik të acidit nukleik dhe pjesa e dytë prezanton teknologjinë e sekuencës.

01

Pjesa I: Teknologjia PCR

Teknologjia PCR

PCR (reaksioni zinxhir i polimerazës) është një nga teknologjitë in vitro të amplifikimit të ADN-së, me një histori prej më shumë se 30 vjetësh.

Teknologjia PCR u prezantua në vitin 1983 nga Kary Mullis nga Cetus, SHBA.Mullis aplikoi për një patentë PCR në 1985 dhe publikoi punimin e parë akademik PCR mbi Shkencën në të njëjtin vit.Mullis fitoi çmimin Nobel në Kimi në 1993.

Parimet themelore të PCR

PCR mund të amplifikojë fragmentet e ADN-së së synuar me më shumë se një milion herë.Parimi është që nën katalizimin e polimerazës së ADN-së, ADN-ja e vargut mëmë përdoret si shabllon dhe një abetare specifike përdoret si pikënisje për shtrirje.Ai përsëritet in vitro përmes hapave të tillë si denatyrimi, pjekja dhe zgjatja.Procesi i ADN-së së vargut bijë plotësues me ADN-në e modelit të vargut mëmë.

Procesi standard i PCR ndahet në tre hapa:

1. Denatyrimi: Përdorni temperaturë të lartë për të ndarë fijet e dyfishta të ADN-së.Lidhjet hidrogjenore midis fijeve të dyfishta të ADN-së prishen në temperatura të larta (93-98°C).

2. Pjekja: Pas ndarjes së ADN-së me dy fije, temperatura ulet në mënyrë që abetarja të mund të lidhet me ADN-në njëvargëshe.

3. Zgjerimi: Polimeraza e ADN-së fillon të sintetizojë vargjet plotësuese përgjatë vargjeve të ADN-së nga abetaret e lidhura kur temperatura ulet.Kur zgjatimi përfundon, një cikël përfundon dhe numri i fragmenteve të ADN-së dyfishohet.

Duke i kthyer këto tre hapa 25-35 herë, numri i fragmenteve të ADN-së do të rritet në mënyrë eksponenciale.

Zgjuarsia e PCR është se mund të dizajnohen primerë të ndryshëm për gjene të ndryshëm të synuar, në mënyrë që fragmentet e gjenit të synuar të mund të amplifikohen në një periudhë të shkurtër kohore.

Deri më tani, PCR mund të ndahet në tre kategori, përkatësisht PCR e zakonshme, PCR sasiore fluoreshente dhe PCR dixhitale.

Gjenerata e parë e PCR-së së zakonshme

Përdorni një instrument të zakonshëm të amplifikimit PCR për të amplifikuar gjenin e synuar, dhe më pas përdorni elektroforezën e xhelit të agarozës për të zbuluar produktin, mund të bëhet vetëm analiza cilësore.

Disavantazhet kryesore të PCR të gjeneratës së parë:

-Të prirur ndaj amplifikimit jospecifik dhe rezultateve false pozitive.

-Zbulimi kërkon shumë kohë dhe operacioni është i rëndë.

-Mund të bëhet vetëm testim cilësor.

PCR sasiore me fluoreshencë të gjeneratës së dytë

PCR sasiore fluoreshente (PCR në kohë reale), e njohur gjithashtu si qPCR, përdoret për të monitoruar akumulimin e produkteve të përforcuara përmes akumulimit të sinjaleve fluoreshente duke shtuar sonda fluoreshente që mund të tregojnë përparimin e sistemit të reagimit dhe për të gjykuar rezultatet përmes lakores së fluoreshencës, dhe mund të kuantizohet me ndihmën e vlerës standarde të lakores.

Për shkak se teknologjia qPCR kryhet në një sistem të mbyllur, probabiliteti i kontaminimit zvogëlohet dhe sinjali i fluoreshencës mund të monitorohet për zbulimin sasior, kështu që është më e përdorura në praktikën klinike dhe është bërë teknologjia dominuese në PCR.

Substancat fluoreshente të përdorura në PCR sasiore fluoreshente në kohë reale mund të ndahen në: sonda fluoreshente TaqMan, fenerë molekularë dhe ngjyra fluoreshente.

1) Sonda fluoreshente TaqMan:

Gjatë amplifikimit PCR, një sondë specifike fluoreshente shtohet duke shtuar një palë primerësh.Sonda është një oligonukleotid dhe të dy skajet janë etiketuar përkatësisht me një grup fluoreshent raportues dhe një grup fluoreshent shues.

Kur sonda është e paprekur, sinjali fluoreshent i emetuar nga grupi raportues absorbohet nga grupi i shuarjes;gjatë amplifikimit PCR, aktiviteti 5'-3' eksonukleaza i enzimës Taq copëton dhe degradon sondën, duke e bërë grupin fluoreshent raportues dhe shuhet. sinjali i fluoreshencës sinkronizohet plotësisht me formimin e produktit PCR.

2) Ngjyrat fluoreshente SYBR:

Në sistemin e reagimit PCR, shtohet një tepricë e ngjyrës fluoreshente SYBR.Pasi boja fluoreshente SYBR është inkorporuar në mënyrë jo specifike në ADN-në me dy fije, ajo lëshon një sinjal fluoreshent.Molekula e bojës SYBR që nuk është e inkorporuar në zinxhir nuk do të lëshojë asnjë sinjal fluoreshent, duke siguruar kështu sinjalin fluoreshent Rritja e produkteve PCR sinkronizohet plotësisht me rritjen e produkteve PCR.SYBR lidhet vetëm me ADN me dy vargje, kështu që kurba e shkrirjes mund të përdoret për të përcaktuar nëse reaksioni PCR është specifik.

3) Fenerët molekularë

Është një sondë oligonukleotide me etiketim të dyfishtë me kërcell, e cila formon një strukturë flokësh prej rreth 8 bazash në skajet 5 dhe 3.Sekuencat e acidit nukleik në të dy skajet janë çiftuar në mënyrë plotësuese, duke bërë që grupi fluoreshent dhe grupi i shuarjes të jenë të ngushtë.Mbylle, nuk do të prodhojë fluoreshencë.

Pasi të krijohet produkti PCR, gjatë procesit të pjekjes, pjesa e mesme e fenerit molekular çiftohet me një sekuencë specifike të ADN-së dhe gjeni fluoreshent ndahet nga gjeni i shues për të prodhuar fluoreshencë.

Disavantazhet kryesore të PCR të gjeneratës së dytë:

Ndjeshmëria ende mungon dhe zbulimi i ekzemplarëve me kopje të ulët nuk është i saktë.

Ekziston ndikimi i vlerës së sfondit dhe rezultati është i ndjeshëm ndaj ndërhyrjeve.

PCR dixhitale e gjeneratës së tretë

PCR dixhitale (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) llogarit numrin e kopjeve të sekuencës së synuar përmes zbulimit të pikës fundore dhe mund të kryejë zbulim të saktë sasior absolut pa përdorur kontrolle të brendshme dhe kurba standarde.

PCR dixhitale përdor zbulimin e pikës fundore dhe nuk varet nga vlera e Ct (pragu i ciklit), kështu që reaksioni dixhital PCR ndikohet më pak nga efikasiteti i amplifikimit dhe toleranca ndaj frenuesve të reaksionit PCR përmirësohet, me saktësi dhe riprodhueshmëri të lartë.

Për shkak të karakteristikave të ndjeshmërisë së lartë dhe saktësisë së lartë, nuk ndërhyhet lehtë nga frenuesit e reaksionit PCR dhe mund të arrijë sasinë e vërtetë absolute pa produkte standarde, e cila është kthyer në një pikë kërkimi dhe aplikimi.

Sipas formave të ndryshme të njësisë së reagimit, ajo mund të ndahet në tre lloje: sisteme mikrofluidike, çip dhe pika.