Vlera Ct është forma më e rëndësishme e prezantimit të rezultatit të PCR sasiore fluoreshente.Përdoret për të llogaritur dallimet e shprehjes së gjeneve ose numrin e kopjeve të gjeneve.Pra, cila është vlera Ct e kuantifikimit të fluoreshencës që konsiderohet e arsyeshme?Si të sigurohet diapazoni efektiv i vlerës Ct?
Çfarë është vlera Ct?
Gjatë procesit të amplifikimit qPCR, numri përkatës i cikleve të amplifikimit (Pragu i Ciklit) kur sinjali i fluoreshencës i produktit të përforcuar arrin pragun e caktuar të fluoreshencës.C qëndron për Cikli dhe T qëndron për Pragun.E thënë thjesht, vlera Ct është numri i cikleve që korrespondojnë kur përforcimi fillestar i shabllonit arrin një sasi të caktuar produkti në qPCR.E ashtuquajtura "një sasi e caktuar produkti" do të shpjegohet më tej.
Çfarë bën vlera Ct?
1.Marrëdhënia ndërmjet amplifikimit eksponencial, sasisë së shabllonit dhe vlerës Ct
Në mënyrë ideale, gjenet në qPCR grumbullohen me amplifikimin eksponencial pas një numri të caktuar ciklesh.Marrëdhënia midis numrit të cikleve të amplifikimit dhe sasisë së produkteve është: Sasia e produktit të përforcuar = shuma fillestare e shabllonit × (1+En) numri i cikleve.Megjithatë, reagimi qPCR nuk është gjithmonë në një situatë ideale.Kur sasia e produktit të përforcuar arrin një "sasi të caktuar produkti", numri i cikleve në këtë kohë është vlera Ct dhe është në periudhën e amplifikimit eksponencial.Marrëdhënia midis vlerës Ct dhe sasisë së shabllonit fillestar: Ekziston një lidhje lineare midis vlerës Ct të shabllonit dhe logaritmit të numrit fillestar të kopjes së shabllonit.Sa më i lartë të jetë përqendrimi fillestar i shabllonit, aq më i vogël është vlera Ct;sa më i ulët të jetë përqendrimi fillestar i shabllonit, aq më e madhe është vlera Ct.
2.Kurba e amplifikimit, pragu i fluoreshencës dhe sasia e caktuar e produktit PCR
Sasia e produktit të amplifikimit qPCR paraqitet drejtpërdrejt në formën e sinjalit fluoreshent, domethënë, kurbës së amplifikimit.Në fazën e hershme të PCR, amplifikimi është në kushte ideale, numri i cikleve është i vogël, akumulimi i produktit është i vogël dhe niveli i fluoreshencës nuk mund të dallohet qartë nga sfondi i fluoreshencës.Pas kësaj, fluoreshenca rritet dhe hyn në fazën eksponenciale.Sasia e produktit PCR mund të zbulohet në një pikë të caktuar kur reagimi PCR është vetëm në fazën eksponenciale, e cila mund të përdoret si "një sasi e caktuar produkti" dhe nga kjo mund të nxirret përmbajtja fillestare e shabllonit.Prandaj, intensiteti i sinjalit të fluoreshencës që korrespondon me një sasi të caktuar produkti është pragu i fluoreshencës.
Në fazën e fundit të PCR, kurba e amplifikimit nuk tregon më përforcim eksponencial dhe hyn në fazën lineare dhe fazën e pllajës.
3.Riprodhueshmëria e vlerave të Ct
Kur cikli PCR arrin numrin e ciklit të vlerës Ct, ai sapo ka hyrë në periudhën e vërtetë të amplifikimit eksponencial.Në këtë kohë, gabimi i vogël nuk është përforcuar, kështu që riprodhueshmëria e vlerës Ct është e shkëlqyer, domethënë, i njëjti shabllon përforcohet në kohë të ndryshme ose në tuba të ndryshëm në të njëjtën kohë.Amplifikimi, vlera e marrë Ct është konstante.
1.Efiçenca e amplifikimit En
Efikasiteti i amplifikimit PCR i referohet efikasitetit me të cilin polimeraza konverton gjenin që do të përforcohet në një amplikon.Efikasiteti i amplifikimit kur një molekulë e ADN-së transformohet në dy molekula të ADN-së është 100%.Efikasiteti i amplifikimit zakonisht shprehet si En.Për të lehtësuar analizën e artikujve pasues, janë paraqitur shkurtimisht faktorët që ndikojnë në efikasitetin e amplifikimit.
| Faktorët ndikues | shpjegim | Si të gjykojmë? |
| A. Frenuesit e PCR | 1. Modeli i ADN-së përmban substanca që pengojnë reaksionin PCR, të tilla si proteina ose detergjentë.2. cDNA pas transkriptimit të kundërt përmban një përqendrim të lartë të përbërësve të ARN-së së shabllonit ose RT-së, të cilët gjithashtu mund të pengojnë reaksionin pasues të PCR. | 1. Nëse ka ndotje mund të gjykohet duke matur raportin e elektroforezës A260/A280 dhe A260/A230 ose ARN.2. Nëse cDNA është holluar sipas një raporti të caktuar pas transkriptimit të kundërt. |
| B. Dizajn jo i duhur i primerit | Primerët nuk pjekjen efikase | Kontrolloni primerët për dimer-abetare ose shirita flokësh, mospërputhje dhe nganjëherë dizajne intronike që përfshijnë. |
| C. Dizajnimi i gabuar i programit të reagimit PCR | 1. Abetaret nuk mund të pjekjen në mënyrë efektive2. Lëshimi i pamjaftueshëm i ADN polimerazës 3. Aktiviteti afatgjatë i ADN polimerazës në temperaturë të lartë u ul | 1. Temperatura e pjekjes është më e lartë se vlera TM e primerit2. Koha para denatyrimit është shumë e shkurtër 3. Koha e secilës fazë të procedurës së reagimit është shumë e gjatë |
| D. Përzierje e pamjaftueshme e reagentëve ose gabime në tubacion | Në sistemin e reagimit, përqendrimi lokal i përbërësve të reaksionit PCR është shumë i lartë ose i pabarabartë, duke rezultuar në përforcim jo-eksponencial të amplifikimit PCR | |
| E. Gjatësia e Amplikonit | Gjatësia e amplikonit është shumë e gjatë, i kalon 300 bp dhe efikasiteti i amplifikimit është i ulët | Kontrolloni që gjatësia e amplikonit të jetë midis 80-300 bp |
| F. Ndikimi i reagentëve qPCR | Përqendrimi i ADN polimerazës në reagent është i ulët ose përqendrimi i joneve në tampon nuk është i optimizuar, duke rezultuar në aktivitetin e enzimës Taq që nuk arrin maksimumin. | Përcaktimi i efikasitetit të amplifikimit me kurbë standarde |
2.Raga e vlerave të Ct
Vlerat e CT variojnë nga 15-35.Nëse vlera e Ct është më e vogël se 15, konsiderohet se amplifikimi është brenda intervalit të periudhës bazë dhe pragu i fluoreshencës nuk është arritur.Në mënyrë ideale, ekziston një marrëdhënie lineare midis vlerës Ct dhe logaritmit të numrit fillestar të kopjes së shabllonit, domethënë kurbës standarde.Nëpërmjet kurbës standarde, kur efikasiteti i amplifikimit është 100%, vlera e llogaritur Ct për përcaktimin sasior të numrit të kopjes së vetme të gjenit është rreth 35. Nëse është më i madh se 35, numri fillestar i kopjes së shabllonit është teorikisht më i vogël se 1, gjë që mund të konsiderohet e pakuptimtë.
Për vargjet e ndryshme të gjeneve Ct, për shkak të ndryshimit në numrin e kopjes së gjenit dhe efikasitetit të amplifikimit në sasinë fillestare të shabllonit, është e nevojshme të bëhet një kurbë standarde për gjenin dhe të llogaritet diapazoni linear i zbulimit të gjenit.
3.Faktorët ndikues të vlerës së Ct
Nga marrëdhënia midis numrit të cikleve të amplifikimit dhe sasisë së produktit: sasia e produktit të përforcuar = sasia e shabllonit fillestar × (1+En) numri i ciklit, mund të shihet se në kushte ideale, sasia e shabllonit fillestar dhe En do të ketë një ndikim negativ në vlerën Ct.Dallimi në cilësinë e shabllonit ose efikasitetin e amplifikimit do të bëjë që vlera Ct të jetë shumë e madhe ose shumë e vogël.
4.Vlera Ct është shumë e madhe ose shumë e vogël
Koha e postimit: Shkurt-22-2023
