PCR është teknologjia më e përdorur për amplifikimin e acidit nukleik dhe përdoret gjerësisht për shkak të ndjeshmërisë dhe specifikës së saj.Megjithatë, PCR kërkon denatyrim termik të përsëritur dhe nuk mund të heqë qafe kufizimet e mbështetjes në instrumente dhe pajisje, gjë që kufizon aplikimin e saj në testimin klinik në terren.

Që nga fillimi i viteve 1990, shumë laboratorë kanë filluar të zhvillojnë teknologji të amplifikimit të temperaturës konstante që nuk kërkon denatyrim termik.Tani ata kanë zhvilluar teknologjinë e amplifikimit izotermik të ndërmjetësuar me lak, teknologjinë e amplifikimit izotermik të zëvendësimit të vargut, teknologjinë e amplifikimit izotermik të rrethit rrotullues dhe varësinë e sekuencës së acidit nukleik.Teknologjia e amplifikimit izotermik dhe teknologji të tjera. 

Lamplifikimi izotermik i ndërmjetësuar nga oop

Parimi i amplifikimit bazohet në faktin se ADN-ja është në një gjendje ekuilibri dinamik në rreth 65°C.Kur çdo primer çiftëzohet me bazë dhe shtrihet në pjesën plotësuese të ADN-së me dy fije, vargu tjetër do të disociohet dhe do të bëhet me një fije floku.

Në këtë temperaturë, ADN-ja përdor 4 primerë specifikë për t'u mbështetur në një polimerazë të ADN-së me zhvendosje të vargut për të bërë që sinteza e ADN-së me zhvendosje të vargut të vetëqarkullojë vazhdimisht.

Së pari përcaktoni 6 rajonet specifike F3, F2, F1, B1, B2, B3 në gjenin e synuar dhe më pas dizajnoni 4 primerë bazuar në këto 6 rajone specifike (siç tregohet në figurën më poshtë):

Abetarja e brendshme e përparme (FIP) është e përbërë nga F1c dhe F2.

Abetarja e brendshme e prapambetur (BIP) përbëhet nga B1c dhe B2, dhe TTTT përdoret si ndarës në mes.

Primerët e jashtëm F3 dhe B3 përbëhen përkatësisht nga rajonet F3 dhe B3 në gjenin e synuar.

Në sistemin e reaksionit LAMP, përqendrimi i primerit të brendshëm është disa herë më i madh se ai i abetares së jashtme.Abetarja e brendshme së pari kombinohet me vargun shabllon për të sintetizuar një varg plotësues për të formuar një varg të dyfishtë të ADN-së.Më pas, primeri i jashtëm kombinohet me vargun shabllon për të formuar një varg të dyfishtë të ADN-së.Nën veprimin e BstDNA polimerazës, lirohet fillesa plotësuese e sintetizuar nga primeri i brendshëm.Pas një sërë reagimesh, vargu plotësues më në fund formon një varg të vetëm të ADN-së me një strukturë trap.

Vetë vargu i vetëm i ADN-së i strukturës së shtangës përdoret si shabllon për të formuar vazhdimisht një strukturë tranzitore të ADN-së me unazë kërcellore me një fund të hapur.Abetarja e brendshme dhe e jashtme e udhëheqin strukturën e ADN-së së strukturës tranzitore të unazës rrjedhëse për t'iu nënshtruar vazhdimisht reaksioneve të zhvendosjes dhe shtrirjes së fijes, dhe më në fund të formojnë struktura të shumta të unazës rrjedhëse me gjatësi të ndryshme.Përzierja e ADN-së.

Avantazhet dhe disavantazhet e amplifikimit izotermik të ndërmjetësuar me lak

Përparësitë e LAMP:

(1) Efikasitet i lartë i amplifikimit, i cili mund të amplifikojë në mënyrë efektive 1-10 kopje të gjenit të synuar brenda 1 ore, dhe efikasiteti i amplifikimit është 10-100 herë më i lartë se ai i PCR-së së zakonshme.

(2) Koha e reagimit është e shkurtër, specifika është e fortë dhe nuk kërkohet pajisje speciale.

Mangësitë e LAMP:

(1) Kërkesat për abetare janë veçanërisht të larta.

(2) Produkti i përforcuar nuk mund të përdoret për klonim dhe sekuencë, por mund të përdoret vetëm për gjykim.

(3) Për shkak të ndjeshmërisë së tij të fortë, është e lehtë të formohen aerosole, duke shkaktuar rezultate false dhe duke ndikuar në rezultatet e testit.

Samplifikimi i zhvendosjes së trendit

Amplifikimi i zhvendosjes së fijes (SDA) është një teknikë e amplifikimit izotermik të ADN-së in vitro e bazuar në reaksionin enzimatik të propozuar për herë të parë nga studiuesi amerikan Walker në 1992.

Sistemi bazë i SDA përfshin një endonukleazë restriktive, një polimerazë të ADN-së me aktivitet zhvendosjeje të vargut, dy palë primerësh, dNTP dhe jonet e kalciumit dhe magnezit dhe sistemet tampon.

Parimi i amplifikimit të zhvendosjes së vargut bazohet në sekuencën e njohjes së endonukleazës restriktiv të modifikuar kimikisht në të dy skajet e ADN-së së synuar.Endonukleaza hap boshllëkun në ADN-në e vargut në vendin e saj të njohjes dhe ADN polimeraza zgjeron hendekun 3' Fund dhe zëvendëson vargun tjetër të ADN-së.

Fijet e vetme të zëvendësuara të ADN-së mund të kombinohen me primerë dhe të zgjerohen në vargje të dyfishta nga ADN polimeraza.Ky proces përsëritet vazhdimisht, në mënyrë që sekuenca e synuar të përforcohet në mënyrë efikase.

Avantazhet dhe disavantazhet e teknologjisë së amplifikimit të zhvendosjes së fillesës

Përparësitë e SDA:

Efikasiteti i amplifikimit është i lartë, koha e reagimit është e shkurtër, specifika është e fortë dhe nuk kërkohet pajisje speciale.

Mangësitë e SDA:

Produktet nuk janë uniforme, dhe disa produkte me një fije dhe me dy fije prodhohen gjithmonë në ciklin SDA, dhe bishti do të ndodhë në mënyrë të pashmangshme kur zbulohet me elektroforezë.

Ramplifikimi i rrethit olling

Amplifikimi i rrethit rrotullues (RCA) propozohet duke u mbështetur në metodën e kopjimit të ADN-së nga organizmat patogjenë me anë të rrethit rrotullues.I referohet përdorimit të ADN-së rrethore me një fije floku si një shabllon në një temperaturë konstante, dhe një polimerazë të veçantë të ADN-së (si p.sh. Phi29) ) Nën veprimin e sintezës së ADN-së rreth rrotullimit për të arritur amplifikimin e gjenit të synuar.

RCA mund të ndahet në përforcim linear dhe përforcim eksponencial.Efikasiteti i RCA lineare mund të arrijë në 10⁵herë, dhe efikasiteti i RCA eksponencial mund të arrijë 10⁹herë.

Dallimi i thjeshtë, siç tregohet në figurën më poshtë, amplifikimi linear a përdor vetëm 1 primer, amplifikimi eksponencial b ka 2 abetare.

RCA lineare quhet gjithashtu RCA me primer të vetëm.Një primer lidhet me ADN-në rrethore dhe zgjerohet nga veprimi i ADN polimerazës.Produkti është një fije lineare e vetme me një numër të madh sekuencash të përsëritura mijëra herë më të mëdha se gjatësia e një laku të vetëm.

Meqenëse produkti i RCA lineare është gjithmonë i lidhur me primerin fillestar, fiksimi i lehtë i sinjalit është një avantazh i madh.

RCA eksponenciale, e njohur gjithashtu si HRCA e përforcuar e degëzuar (Hyper branched RCA), në RCA eksponenciale, një abetare amplifikon produktin RCA, primeri i dytë hibridizohet me produktin RCA dhe zgjatet, dhe zëvendësimi është tashmë i lidhur me produktin RCA. Primerët në rrjedhën e poshtme zgjerojnë fillesën, dhe përsërisin një produkt shtues dhe zëvendësues RCA.

Përparësitë dhe disavantazhet e amplifikimit të acidit nukleik të rrethit rrotullues

Përparësitë e RCA:

Ndjeshmëri e lartë, specifikë e mirë dhe funksionim i lehtë.

Mangësitë e RCA:

Probleme në sfond gjatë zbulimit të sinjalit.Gjatë reaksionit RCA, sonda e bllokimit të paqarkulluar dhe modeli i ADN-së ose ARN-së së sondës së palidhur mund të gjenerojnë disa sinjale sfondi. 

Namplifikimi i bazuar në sekuencën e ukleikacideve

Amplifikimi i bazuar në sekuencën e acidit nukleik (NASBA) është një teknologji e re e zhvilluar në bazë të PCR.Është një përforcim i vazhdueshëm dhe izotermik i acidit nukleik i udhëhequr nga një palë primerësh me një sekuencë promotore T7.Teknologjia mund të amplifikojë modelin e ARN-së me rreth 109 herë në rreth 2 orë, që është 1000 herë më e lartë se metoda konvencionale PCR dhe nuk kërkon pajisje speciale.

Kjo teknologji është përdorur për diagnostikimin e shpejtë të sëmundjeve sapo është shfaqur, dhe shumë kompani aktualisht e përdorin këtë metodë në kutitë e zbulimit të ARN-së.

Megjithëse amplifikimi i ARN-së mund të përdorë gjithashtu teknologjinë PCR të transkriptimit të kundërt, NASBA ka avantazhet e veta: mund të kryhet në kushte relativisht konstante të temperaturës dhe është më i qëndrueshëm dhe më i saktë se teknologjia tradicionale PCR.

Reaksioni është në 41 gradë Celsius dhe kërkon AMV (virusi i mieloblastozës së shpendëve) transkriptazë e kundërt, RNase H, ARN polimeraza T7 dhe një palë primerësh për t'u përfunduar.

Procesi kryesisht përfshin:

Abetarja e përparme përmban sekuencën plotësuese të promotorit T7.Gjatë reaksionit, primeri përpara lidhet me vargun e ARN-së dhe katalizohet nga enzima AMV për të formuar një varg të dyfishtë ADN-ARN.

RNaza H tret ARN-në në dyvargëz hibride dhe ruan ADN-në njëvargëshe.

Nën veprimin e primerit të kundërt dhe enzimës AMV, formohet një varg i dyfishtë i ADN-së që përmban sekuencën e promotorit T7.

Nën veprimin e T7 ARN polimerazës, procesi i transkriptimit përfundon dhe prodhohet një sasi e madhe e ARN-së së synuar.

Përparësitë e NASBA:

(1) Abetarja e saj ka një sekuencë promotore T7, por ADN-ja e huaj me dy zinxhirë nuk ka sekuencë promotore T7 dhe nuk mund të përforcohet, kështu që kjo teknologji ka specifikë dhe ndjeshmëri të lartë.

(2) NASBA përfshin drejtpërdrejt procesin e transkriptimit të kundërt në reaksionin e amplifikimit, duke shkurtuar kohën e reagimit.

Disavantazhet e NASBA:

(1) Komponentët e reagimit janë më të komplikuar.

(2) Tre lloje enzimash kërkohen për të rritur koston e reagimit.