PCR, të shumëfishta PCR, PCR in situ, PCR e kundërt, RT-PCR, qPCR (1)-PCR

Ne do të zgjidhim konceptet, hapat dhe detajet e PCR të ndryshme

Ⅰ. PCR

Reaksioni zinxhir i polimerazës, i referuar si PCR, është një teknologji biologjike molekulare që përdoret për të zmadhuar fragmente specifike të ADN-së.Mund të konsiderohet si një replikim i veçantë i ADN-së in vitro.ADN polimeraza (DNA Polymeraza I) u zbulua qysh në vitin 1955, dhe Klenow Fragment i E. Coli, i cili ka vlerë eksperimentale dhe praktike, u zbulua nga Dr. H. Klenow në fillim të viteve 1970, por për shkak se kjo enzimë nuk e toleron temperaturën, temperatura e lartë mund ta degjenerojë atë, kështu që nuk e bën reaksionin e degjenerimit të lartë të polimerazës.Enzimat në përdorim sot (të quajtura Taq polimeraza), u izoluan nga Thermus aquaticus, një bakter i burimeve të nxehtë në vitin 1976. Karakteristika e tij është se mund t'i rezistojë temperaturës së lartë dhe është një enzimë ideale, por përdoret gjerësisht pas viteve 1980.Koncepti origjinal i prototipit origjinal primitiv të PCR është i ngjashëm me riparimin dhe kopjimin e gjeneve, i cili u propozua nga Dr. KJell Kleppe në 1971. Ai publikoi kopjen e parë të gjenit të thjeshtë dhe afatshkurtër (të ngjashme me reaksionet e para të dy cikleve të PCR).PCR i zhvilluar sot u zhvillua nga Dr. Kary B. Mullis në 1983. Dr. Mullis u shërbeu kompanive të PE atë vit, kështu që PE ka një status të veçantë në industrinë e PCR.Dr. Mullis botoi zyrtarisht punimin e parë të lidhur me Saikin dhe të tjerët në 1985. Që atëherë, përdorimi i PCR është mijëra kilometra në ditë dhe cilësia e punimeve të lidhura mund të thuhet se i bën shumë metoda të tjera kërkimore të papëlqyeshme.Më pas, teknologjia PCR përdoret gjerësisht në kërkimin shkencor biologjik dhe aplikimet klinike, duke u bërë teknologjia më e rëndësishme e kërkimit të biologjisë molekulare.Mullis fitoi gjithashtu çmimin Nobel në 1993 në Kimi.

PCRParimi

Parimi bazë i teknologjisë PCR është i ngjashëm me procesin e replikimit natyror të ADN-së dhe specifika e tij varet nga primeri oligonukleotid që është plotësues i të dy skajeve të sekuencës së synuar.PCR përbëhet nga tre hapa bazë të reaksioneve degjenerim-pjekje-zgjerim: ①Degjenerimi i ADN-së shabllon: Pasi ADN-ja e shabllonit të nxehet në rreth 93°C për një periudhë të caktuar kohe, zgjidhja e dyfishtë e ADN-së për ADN-në me zinxhir të dyfishtë e formuar nga amplifikimi i PCR i ADN-së së shabllonit, e bëjnë atë një reaksion të vetëm të rrumbullakët për t'u kombinuar me zinxhirin tjetër.②Pjekja (përbërja) e ADN-së së shabllonit dhe abetares: Pasi ADN-ja e shabllonit nxehet dhe degjenerohet në një zinxhir të vetëm, temperatura bie në rreth 55°C.Sekuenca plotësuese e primerit dhe shabllonit të ADN-së me një zinxhir të vetëm.③Zgjerimi i abetares: shabllon i ADN-së-lidhja e primerit bazohet në veprimin e polimerazës TaqDNA, me dNTP si lëndë e parë e reagimit.Mbani parimin e përsëritjes, sintetizoni një zinxhir të ri kopjesh gjysmë të rezervuar që plotëson zinxhirin e ADN-së së shabllonit dhe përsëritni ciklin degjenerim-pjekje-zgjatje të tre proceseve mund të marrin më shumë "zinxhirë kopjesh gjysmë të rezervuar" dhe ky zinxhir i ri është sërish i disponueshëm. Bëhuni një shabllon për ciklin tjetër.Duhen 2-4 minuta për të përfunduar ciklin, gjeni i synuar mund të përforcohet disa milionë herë në 2-3 orë.

StandardPCRSistemi i reagimit

Pesë elementë të reaksionit PCR

Ekzistojnë kryesisht pesë lloje substancash të përfshira në reaksionin PCR, përkatësisht primer, enzimë, dNTP, shabllon dhe bufer (kërkohet Mg2+).[Procedura PCR]

Procesi standard i PCR ndahet në tre hapa

1. Degjenerimi i ADN-së (90°C-96°C): Modelet e ADN-së me zinxhir të dyfishtë nën veprim termik, lidhjet e hidrogjenit thyhen, duke formuar një ADN me një zinxhir të vetëm.

2. Pjekja (25℃ -65℃): Temperatura e sistemit zvogëlohet, abetarja kombinohet me shabllonin e ADN-së për të formuar një zinxhir lokal të dyfishtë.

3. Zgjatja (70℃ -75℃): Nën veprimin e enzimës Taq (rreth 72°C, aktiviteti më i mirë), dNTP përdoret si lëndë e parë, shtrihet nga fundi 5' i abetares → fundi 3', sinteza dhe shabllon plotësojnë njëri-tjetrin zinxhirin e ADN-së.

Çdo cikël denatyrohet, pjekja dhe zgjatet, duke dyfishuar përmbajtjen e ADN-së.Aktualisht, për shkak të zonës së shkurtër të amplifikimit, disa PCR mund të përsëriten në një kohë shumë të shkurtër edhe nëse aktiviteti i enzimës Taq nuk është optimal, kështu që mund të ndryshohet në dy hapa, domethënë pjekja dhe shtrirja mund të kryhen në 60°C-65°C në të njëjtën kohë.Për të reduktuar procesin e ngritjes dhe ftohjes dhe për të përmirësuar shpejtësinë e reagimit.

Karakteristikat e reagimit PCR

● Specifikimi i lartë

Faktorët specifikë vendimtarë të përgjigjes PCR janë: ① Kombinimi specifik i primerit dhe modelit të ADN-së.②Parimi i çiftimit të bazës.③ Besnikëria e reaksionit të sintezës së polimerazës TaqDNA.④ Specifikimi dhe konservativiteti i gjenit të synuar.

Kombinimi i saktë i abetareve dhe shablloneve është çelësi.Lidhja e primerit dhe shabllonit dhe zgjatja e zinxhirit të primerit bazohen në parimin e përputhjes së bazës alkaline.Besnikëria e reaksioneve të sintezës së polimerazës dhe rezistenca ndaj temperaturës së lartë të polimerazës së ADN-së Taq për të bërë lidhjen (përbërjen) e shabllonit dhe abetares në reaksion mund të kryhet në një temperaturë më të lartë.Specifikimi i kombinimit është rritur shumë.Klipi mund të ruajë një shkallë të lartë korrektësie.Duke zgjedhur një rajon gjenetik të synuar me konservativitet të lartë dhe konservativitet të lartë, specifika e tij është më e lartë.

● Ndjeshmëri e lartë

Vëllimi i prodhimit të produkteve PCR rritet me indeks, i cili mund të zgjerojë shabllonin fillestar të Picker (PG=10-12) për të rritur nivelin e mikrokontrolluesit në nivelin e mikrogramëve (μg= -6).Një qelizë e synuar mund të zbulohet nga 1 milion qeliza;në zbulimin e viruseve, ndjeshmëria e PCR mund të arrijë 3 RFU (njësi të formuara nga pika boshe);shkalla minimale e zbulimit në shkencën bakteriale është 3 baktere.

● E thjeshtë dhe e shpejtë

Reflektimi PCR përdor një polimerazë të ADN-së Taq me temperaturë të lartë, e cila shton tretësirën e reaksionit në të njëjtën kohë, domethënë një reaksion degjenerimi-anneal-zgjatjeje në solucionin e amplifikimit të ADN-së dhe në tenxheren e banjës me ujë.Në përgjithësi, reaksioni i amplifikimit përfundon në 2 deri në 4 orë.Produktet e shtuara përgjithësisht analizohen me shpatë elektrike dhe nuk kanë nevojë të përdorin izotope, pa ndotje radioaktive dhe promovim të lehtë.

● Pastërtia e mostrës është e ulët

Nuk ka nevojë të ndahen viruset ose bakteret dhe qelizat e kulturës.Produktet e papërpunuara të ADN-së dhe ARN-ja mund të përdoren si amplifikues.Zbulimi i amplifikimit të ADN-së mund të përdoret drejtpërdrejt duke përdorur ekzemplarë klinikë si gjaku, lëngu i trupit, lëngu për larjen e kollës, flokët, qelizat dhe indet e gjalla.

PCRproblemet e zakonshme

● Negativ i rremë, pa breza të përforcuar

Fazat kryesore të reaksionit PCR përfshijnë: ① përgatitjen e acideve nukleike model, ② cilësinë dhe specifikën e primerëve, ③ cilësinë e enzimave ④ kushtet e ciklit PCR.Gjetja e arsyes duhet analizuar dhe studiuar edhe për lidhjet e mësipërme.

Modelet: ① Shablloni përmban proteina të ndryshme, ② Shablloni përmban një frenues të enzimës Taq, ③ Proteina në shabllon nuk eliminohet, veçanërisht proteina e grupit në kromozom.⑤ Degjenerimi i acidit nukleik të çminuar nuk është i plotë.Kur cilësia e enzimave dhe abetareve është e mirë, nuk ka brez amplifikimi, që ka shumë të ngjarë të jetë trajtimi tretës i ekzemplarëve.Ka diçka që nuk shkon me procesin e nxjerrjes së shabllonit të acidit nukleik, kështu që për të përgatitur një zgjidhje efektive dhe të qëndrueshme të tretjes, procedura e tij duhet të rregullohet dhe jo të ndryshohet në mënyrë arbitrare.

Inaktivizimi i enzimës: një enzimë e re ose enzima të vjetra dhe të reja duhet të përdoren së bashku për të analizuar nëse aktiviteti i enzimës është i humbur ose i pamjaftueshëm, duke çuar në negativë të rremë.Duhet të theksohet se enzima Taq ose bromidi etidium ndonjëherë harrohet.

Primer: cilësia e abetares, përqendrimi i abetares dhe nëse përqendrimi i dy abetareve është simetrik.Është një arsye e zakonshme për dështimin e PCR ose brezi në rritje nuk është ideal dhe i prirur për t'u shpërndarë.Ka probleme me cilësinë e abetareve të disa numrave të grupeve.Dy primerët kanë një përqendrim të lartë dhe një përqendrim të ulët, duke shkaktuar përforcim asimetrik me efikasitet të ulët.Kundërmasat janë: ① Zgjidhni një primer të mirë për të sintetizuar njësitë.② Përqendrimi i abetares jo vetëm që varet nga vlera e OD, por gjithashtu i kushton vëmendje lëngut origjinal të abetares për të bërë elektroforezë xhel sheqeri agar.Duhet të ketë një zonë të shiritit të primerit dhe shkëlqimi i dy abetareve duhet të jetë përgjithësisht i qëndrueshëm.Brezi, PCR mund të dështojë në këtë moment dhe duhet zgjidhur me njësinë e sintezës së primerit.Nëse një abetare është e lartë, shkëlqimi është i ulët dhe përqendrimi i tij duhet të jetë i balancuar kur hollohet.③ Primeri duhet të paguhet dhe të ruhet në një përqendrim të lartë për të parandaluar ngrirjen e shumëfishtë ose ftohjen afatgjatë të pjesëve të frigoriferit, gjë që do të shkaktojë përkeqësimin dhe degradimin e primerit.④ Dizajni i abetares është i paarsyeshëm, për shembull, gjatësia e abetares është e pamjaftueshme, dhe grupi diku është formuar midis abetareve.

Përqendrimi i Mg2+: Përqendrimi i jonit Mg2+ ka një ndikim të madh në efikasitetin e amplifikimit të PCR.Përqendrimi i tepërt mund të zvogëlojë seksin e kundërt të amplifikimit PCR.Nëse përqendrimi është shumë i ulët, dalja e amplifikimit PCR madje do të bëjë që amplifikimi PCR të dështojë pa brezin e zgjerimit.

Ndryshimi i volumit të reaksionit: Vëllimi i përdorur në amplifikimin PCR është 20ul, 30ul, dhe 50ul ose 100uL, vëllimi i madh i aplikacionit për amplifikimin PCR vendoset sipas qëllimeve të ndryshme të kërkimit shkencor dhe testimit klinik.Pasi të keni bërë vëllime të vogla si 20ul, është e nevojshme të bëni një gjendje kordoni kur bëni madhësinë, përndryshe do të dështojë.

Arsyet fizike: Transformimi është shumë i rëndësishëm për amplifikimin e PCR.Nëse temperatura e degjenerimit është e ulët, koha e degjenerimit është e shkurtër, ka të ngjarë të ndodhë në negativë të rremë;temperatura shumë e ulët e pjekjes mund të shkaktojë amplifikim jo specifik dhe të zvogëlojë efikasitetin e amplifikimit specifik.Ndikon shumë në kombinimin e primerëve dhe shablloneve për të reduktuar efikasitetin e amplifikimit të PCR.Ndonjëherë është e nevojshme të përdoren termometra standardë për të zbuluar ndryshueshmërinë, pjekjen dhe temperaturën e zgjatur në tenxhere shtesë ose të tretshme në ujë, që është një nga arsyet e dështimit të PCR.

Variantet e sekuencës së synuar: Nëse sekuenca e synuar ndodh, një mutacion ose fshirje, kombinimi i prototipit dhe shabllonit kombinohet, ose për shkak të mungesës së një sekuence të synuar, primeri dhe shablloni do të humbasin sekuencën plotësuese dhe amplifikimi i tij PCR nuk do të jetë i suksesshëm.

● Pozitiv i rremë

Brezi i amplifikimit PCR duket në përputhje me brezin e sekuencës së synuar, dhe ndonjëherë brezi i tij është më i rregullt dhe më i lartë.

Dizajni i primerit nuk është i përshtatshëm: sekuenca e përzgjedhur e amplifikimit dhe sekuenca e amplifikimit jo-qëllim kanë homologe, kështu që kur amplifikimi me PCR, produktet e përforcuara të PCR janë sekuenca jo të qëllimshme.Sekuenca e synuar është shumë e shkurtër ose abetarja është shumë e shkurtër dhe është e prirur për false pozitive.Duhet ridizajnuar.

Ndotja e kryqëzuar e sekuencës së synuar ose e produkteve të amplifikimit: Ka dy arsye për këtë ndotje: Së pari, ndotja e tërthortë e të gjithë gjenomit ose segmenteve të mëdha, që çon në pozitive false.Ky lloj pozitiv i rremë mund të zgjidhet me metodat e mëposhtme: Jini të kujdesshëm dhe të butë gjatë operimit për të parandaluar që sekuenca e synuar të thithet në armën e mostrës ose të spërkatet nga tubi centrifugal.Me përjashtim të enzimave dhe substancave që nuk mund t'i rezistojnë temperaturave të larta, të gjithë reagentët ose pajisjet duhet të dezinfektohen me presion të lartë.Tubat centrifugale dhe mostrat duhet të përdoren në të njëjtën kohë.Kur është e nevojshme, përpara shtimit të ekzemplarëve, tubi i reagimit dhe reagenti ekspozohen ndaj rrezeve ultravjollcë për të shkatërruar acidin nukleik ekzistues.Së dyti, fragmente të vogla në ndotjen e ajrit.Këto fragmente të vogla janë më të shkurtra se sekuenca e synuar, por ato kanë një homologji të caktuar.Mund të bashkohet me njëra-tjetrën.Pas plotësimit të primerëve, produkti PCR mund të zgjerohet, gjë që do të shkaktojë prodhim fals pozitiv.Mund të përdoret për të reduktuar ose eliminuar metodën nest PCR.

● Shfaqet brezi jospecifik i amplifikimit

Brezat që u shfaqën pas amplifikimit PCR janë të papajtueshme me madhësinë e pritshme, ose të mëdha ose të vogla, ose në të njëjtën kohë, ose në të njëjtën kohë, brezat e amplifikimit specifik dhe brezat e amplifikimit jospecifik.Shfaqja e brezave jospecifik është: Së pari, abetaret janë jo të plota plotësuese me sekuencën e synuar, ose polimerizimi i primerit për të formuar një grup të ndryshëm.E dyta është se përqendrimi i joneve MG2+ është shumë i lartë, temperatura e pjekjes është shumë e ulët dhe numri i cikleve PCR është i lidhur.Së dyti, cilësia dhe sasia e enzimave.Shpesh, enzimat e disa burimeve janë të prirura për breza jo të veçantë dhe enzimat e burimit tjetër nuk ndodhin.Ndonjëherë ndodh edhe amplifikimi jo specifik i enzimave.Kundërmasat janë: atraktivë të ridizajnuar nëse është e nevojshme.Zvogëloni sasinë e enzimës ose zëvendësoni enzimën e një burimi tjetër.Zvogëloni sasinë e primarit, rrisni sasinë e shablloneve në mënyrë të përshtatshme dhe zvogëloni numrin e cikleve.Rriteni siç duhet temperaturën e pjekjes ose përdorni metodën me dy pika të temperaturës (degjenerimi 93°C, pjekja dhe shtrirja në rreth 65°C).

● Shfaqet një tërheqje ose shirit lyerjeje

Përforcimi PCR ndonjëherë duket se aplikohet ose është i prerë ose rrip i ngjashëm me tapetin.Për arsye, për shkak të sasisë së tepërt të enzimave ose cilësisë së dobët të enzimës, përqendrimi i dNTP është shumë i lartë, përqendrimi i Mg2+ është shumë i lartë, temperatura e pjekjes është shumë e ulët dhe numri i cikleve është shumë i madh.Kundërmasat janë: ①Zvogëloni sasinë e enzimave, ose ndryshoni enzimën e një burimi tjetër.②Zvogëloni përqendrimin e dNTP ③ Zvogëloni siç duhet përqendrimin e Mg2+.④Rrisni sasinë e shablloneve dhe zvogëloni numrin e cikleve.

Produkte të ngjashme

PCR Heroᵀᴹ (Me bojë)

◮ Besueshmëri më e lartë: 6 herë më e lartë se enzima e zakonshme Taq;

◮ Shpejtësi më e shpejtë e përforcimit

◮ Përshtatshmëri më e madhe e shabllonit

◮ Efikasitet më i lartë i amplifikimit

◮ Toleranca ndaj mjedisit është më e fortë: vendoset në 37°C për një javë, duke mbajtur më shumë se 90% aktivitet;

◮ Ka aktivitet 5'→3' ADN polimerazë dhe 5'→3' aktivitet ekzonukleazë, pa aktivitet ekzonukleazë 3'→5'.

PCR Easyᵀᴹ (Me ngjyrues)

Sistemi unik i reagimit dhe Taq ADN Polimeraza me efikasitet të lartë bëjnë që reaksioni PCR të ketë efikasitet, specifikë dhe ndjeshmëri më të lartë amplifikimi.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Një hap)-SYBR Green I

◮ Kompleti me një hap bën transkriptimin e kundërt dhe qPCR dy reaksione në të njëjtin tub, duhet vetëm të shtoni ARN shabllon, primerë specifikë PCR dhe ddH pa RNase₂O.

◮ Kompleti mund të analizojë shpejt dhe në mënyrë sasiore ARN virale ose ARN-në gjurmë.

◮ Kompleti përdor një reagent unik të transkriptimit të kundërt Foregene dhe Foregene HotStar Taq ADN Polymerase të kombinuar me një sistem unik reagimi për të përmirësuar në mënyrë efektive efikasitetin e amplifikimit dhe specifikën e reaksionit.

◮ Sistemi i optimizuar i reagimit bën që reaksioni të ketë ndjeshmëri më të lartë zbulimi, stabilitet më të fortë termik dhe tolerancë më të mirë.

◮ RT-qPCR Lehtë^TM(Një hap)-Kit SYBR Green I vjen me bojë të brendshme referuese ROX, e cila mund të përdoret për të eliminuar gabimet e sfondit të sinjalit dhe sinjalit midis puseve, gjë që është e përshtatshme për klientët për t'u përdorur në modele të ndryshme të instrumenteve sasiore PCR.

RT Lehtë^TMII (Master Premix për sinteza e cADN-së së vargut të parë përPCR në kohë reale)

-Aftësia efikase për të hequr gDNA, e cila mund të heqë gDNA në shabllon brenda 2 minutash.

-Sistemi efikas i transkriptimit të kundërt, duhen vetëm 15 minuta për të përfunduar sintezën e cDNA-së së vargut të parë.

-Tabele komplekse: shabllonet me përmbajtje të lartë GC dhe strukturë komplekse dytësore mund të kthehen gjithashtu me efikasitet të lartë.

-Sistemi i transkriptimit të kundërt me ndjeshmëri të lartë, shabllonet e nivelit pg mund të marrin gjithashtu cDNA me cilësi të lartë.

-Sistemi i transkriptimit të kundërt ka stabilitet të lartë termik, temperatura optimale e reagimit është 42℃, dhe ende ka performancë të mirë të transkriptimit të kundërt në 50℃.