PCR (reaksioni zinxhir i polimerazës) është një nga teknologjitë e amplifikimit të ADN-së in-vitro, me një histori prej më shumë se 30 vjetësh.

Teknologjia PCR u krijua nga Kary Mullis nga Cetus, SHBA në 1983. Mullis aplikoi për një patentë PCR në 1985 dhe botoi punimin e parë akademik PCR mbi Shkencën në të njëjtin vit.Mullis u nderua me çmimin Nobel në kimi në vitin 1993 për punën e tij.

Parimet themelore të PCR

PCR mund të amplifikojë fragmentet e ADN-së së synuar me më shumë se një milion herë.Parimi është nën katalizimin e ADN polimerazës, duke përdorur ADN-në e vargut mëmë si shabllon dhe abetare specifike si pikënisje për shtrirje.Ai përsëritet in vitro përmes hapave të tillë si denatyrimi, pjekja dhe zgjatja.Procesi i ADN-së së vargut bijë plotësues me ADN-në e modelit të vargut mëmë.

Procesi standard i PCR ndahet në tre hapa:

1.Denatyrimi: Përdorni temperaturë të lartë për të ndarë fijet e dyfishta të ADN-së.Lidhja hidrogjenore midis fijeve të dyfishta të ADN-së prishet në temperaturë të lartë (93-98℃).

2. Pjekja: Pasi të ndahet ADN-ja me dy fije, uleni temperaturën në mënyrë që abetarja të mund të lidhet me ADN-në njëvargëshe.

3. Zgjerimi: Polimeraza e ADN-së fillon të sintetizojë vargjet plotësuese përgjatë vargjeve të ADN-së nga abetaret e lidhura kur temperatura ulet.Kur zgjatimi përfundon, një cikël përfundon dhe numri i fragmenteve të ADN-së dyfishohet

Duke i kthyer këto tre hapa 25-35 herë, numri i fragmenteve të ADN-së do të rritet në mënyrë eksponenciale.

Zgjuarsia e PCR është se mund të dizajnohen primerë të ndryshëm për gjene të ndryshëm të synuar, në mënyrë që fragmentet e gjenit të synuar të mund të përforcohen në një periudhë të shkurtër kohore.

Deri më tani, PCR mund të ndahet në tre kategori, përkatësisht PCR e zakonshme, PCR sasiore fluoreshente dhe PCR dixhitale.

Gjenerata e parë e PCR-së së zakonshme

Përdorni një instrument të zakonshëm të amplifikimit PCR për të amplifikuar gjenin e synuar, dhe më pas përdorni elektroforezën e xhelit të agarozës për të zbuluar produktin, mund të bëhet vetëm analiza cilësore.

Disavantazhet kryesore të PCR të gjeneratës së parë:

1.Te prirur ndaj amplifikimit jospecifik dhe rezultateve false pozitive.

2. Zbulimi kërkon një kohë të gjatë dhe operacioni është i rëndë.

3. Mund të bëhet vetëm test cilësor

PCR e gjeneratës së dytë në kohë reale

PCR në kohë reale, i njohur gjithashtu si qPCR, përdor sonda fluoreshente që mund të tregojnë përparimin e sistemit të reagimit dhe monitoron akumulimin e produkteve të përforcuara përmes akumulimit të sinjaleve fluoreshente dhe gjykon rezultatet përmes lakores së fluoreshencës.Ajo mund të matet me ndihmën e vlerës Cq dhe kurbës standarde.

Për shkak se teknologjia qPCR kryhet në një sistem të mbyllur, probabiliteti i kontaminimit zvogëlohet dhe sinjali i fluoreshencës mund të monitorohet për zbulimin sasior, kështu që është më e përdorura në praktikën klinike dhe është bërë teknologjia dominuese në PCR.

Substancat fluoreshente të përdorura në PCR sasiore fluoreshente në kohë reale mund të ndahen në: sonda fluoreshente TaqMan, fenerë molekularë dhe bojë fluoreshente.

1) Sonda fluoreshente TaqMan:

Gjatë amplifikimit PCR, një sondë fluoreshente specifike shtohet duke shtuar një palë primer.Sonda është një oligonukleotid dhe të dy skajet janë të etiketuara me një grup fluoreshente raportues dhe një grup fluoreshent shues.

Kur sonda është e paprekur, sinjali fluoreshent i emetuar nga grupi raportues absorbohet nga grupi i shuarjes;gjatë amplifikimit PCR, aktiviteti 5'-3' eksonukleaza i enzimës Taq copëton dhe degradon sondën, duke e bërë grupin fluoreshent raportues dhe shuhet. sinjali i fluoreshencës sinkronizohet plotësisht me formimin e produktit PCR.

2) Bojë fluoreshente SYBR:

Në sistemin e reagimit PCR, shtohet një tepricë e ngjyrës fluoreshente SYBR.Pasi boja fluoreshente SYBR është inkorporuar në mënyrë jo specifike në ADN-në me dy fije, ajo lëshon një sinjal fluoreshent.Molekula e bojës SYBR që nuk është e inkorporuar në zinxhir nuk do të lëshojë asnjë sinjal fluoreshent, duke siguruar kështu sinjalin fluoreshent Rritja e produkteve PCR sinkronizohet plotësisht me rritjen e produkteve PCR.SYBR lidhet vetëm me ADN me dy vargje, kështu që kurba e shkrirjes mund të përdoret për të përcaktuar nëse reaksioni PCR është specifik.

3) Fener molekular:

Është një sondë oligonukleotide me etiketim të dyfishtë me kërcell, e cila formon një strukturë flokësh prej rreth 8 bazash në skajet 5 dhe 3.Sekuencat e acidit nukleik në të dy skajet janë çiftuar në mënyrë plotësuese, duke bërë që grupi fluoreshent dhe grupi i shuarjes të jenë të ngushtë.Mbylle, nuk do të prodhohet fluoreshencë.

Pasi të krijohet produkti PCR, gjatë procesit të pjekjes, pjesa e mesme e fenerit molekular çiftohet me një sekuencë specifike të ADN-së dhe gjeni fluoreshent ndahet nga gjeni i shues për të prodhuar fluoreshencë.

Disavantazhet kryesore të PCR të gjeneratës së dytë:

Ndjeshmëria ende mungon dhe zbulimi i ekzemplarëve me kopje të ulët është i pasaktë.

Ekziston ndikimi i vlerës së sfondit dhe rezultati është i ndjeshëm ndaj ndërhyrjeve.

Kur ka frenues PCR në sistemin e reagimit, rezultatet e zbulimit janë të ndjeshme ndaj ndërhyrjeve.

PCR dixhitale e gjeneratës së tretë

PCR dixhitale (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) llogarit numrin e kopjeve të sekuencës së synuar përmes zbulimit të pikës fundore dhe mund të kryejë zbulim të saktë sasior absolut pa përdorur kontrolle të brendshme dhe kurba standarde.

PCR dixhitale përdor zbulimin e pikës fundore dhe nuk varet nga vlera e Ct (pragu i ciklit), kështu që reaksioni dixhital PCR ndikohet më pak nga efikasiteti i amplifikimit dhe toleranca ndaj frenuesve të reaksionit PCR përmirësohet, me saktësi dhe riprodhueshmëri të lartë.

Për shkak të karakteristikave të ndjeshmërisë së lartë dhe saktësisë së lartë, nuk ndërhyhet lehtë nga frenuesit e reaksionit PCR dhe mund të arrijë sasinë e vërtetë absolute pa produkte standarde, e cila është kthyer në një pikë kërkimi dhe aplikimi.

Sipas formave të ndryshme të njësisë së reagimit, ajo mund të ndahet në tre lloje kryesore: sisteme mikrofluidike, çip dhe pika.

1) PCR dixhitale mikrofluidike, mdPCR:

Bazuar në teknologjinë mikrofluidike, shablloni i ADN-së është i ndarë.Teknologjia mikrofluidike mund të realizojë nano-përmirësimin e mostrës ose gjenerimin e pikave më të vogla, por pikat kanë nevojë për një metodë të veçantë adsorbimi dhe më pas të kombinohen me sistemin e reagimit PCR.mdPCR është adoptuar gradualisht nga metoda të tjera zëvendësuese.

2) PCR dixhitale e bazuar në pika, ddPCR:

Përdorni teknologjinë e gjenerimit të pikave ujë në vaj për të përpunuar kampionin në pika dhe ndani sistemin e reagimit që përmban molekula të acidit nukleik në mijëra pika nano-shkallë, secila prej të cilave nuk përmban molekulën e synuar të acidit nukleik që do të zbulohet, ose Përmban një deri në disa molekula objektive të acidit nukleik që do të testohen.

3) PCR dixhitale e bazuar në çip, cdPCR:

Përdorni teknologjinë e integruar të rrugës së lëngut për të gdhendur shumë mikrotuba dhe mikrokavitete në vaferë silikoni ose xhami kuarci, dhe kontrolloni rrjedhën e tretësirës përmes valvulave të ndryshme të kontrollit dhe ndani lëngun e mostrës në nanometra të së njëjtës madhësi në puset e reagimit për Reagimin PCR dixhital për të arritur sasinë absolute.

Disavantazhet kryesore të PCR të gjeneratës së tretë:

Pajisjet dhe reagentët janë të shtrenjtë.

Kërkesat për cilësinë e shabllonit janë të larta.Nëse sasia e shabllonit tejkalon sasinë e mikrosistemit, do të jetë e pamundur të përcaktohet sasia, dhe nëse është shumë e vogël, saktësia e kuantifikimit do të reduktohet.

Pozitive false mund të gjenerohen gjithashtu kur ka përforcim jo specifik.