COVID-19 është një sëmundje infektive e shkaktuar nga sindroma e rëndë akute e frymëmarrjes, Coronavirus Type 2. Kur një person është i infektuar, simptomat më të zakonshme përfshijnë ethe, kollë dhe gulçim.

Mostrat e përdorura për testim mund të mblidhen me strisone nazofaringeale ose shtupa orofaringeale.

Çfarë është PCR?

Metoda standarde e zbulimit të koronavirusit është reaksioni zinxhir i polimerazës, PCR.Kjo është një metodë e përdorur gjerësisht në biologjinë molekulare.Ai mund të kopjojë shpejt miliona në miliarda fragmente specifike të ADN-së.

Koronavirusi i ri përmban një gjenom ARN me një zinxhir shumë të gjatë.Për të zbuluar këto viruse me PCR, molekulat e ARN-së duhet të shndërrohen në sekuencat e tyre plotësuese të ADN-së me anë të transkriptazës së kundërt, dhe më pas ADN-ja e saposintetizuar mund të amplifikohet me procedura standarde PCR, e cila zakonisht njihet si RT-PCR.

Procesi RT-PCR

Ekstraktimi i ARN-së

Për të kryer këtë metodë, në thelb duhet të nxirret ARN virale.Një shumëllojshmëri e kompleteve të pastrimit të ARN-së mund të përdoren për ndarje të përshtatshme, të shpejtë dhe efektive.

Për të nxjerrë ARN virale duke përdorur një komplet komercial, së pari shtoni kampionin në një tub mikrocentrifuge dhe më pas përzieni atë me tampon lize.Ky tampon është shumë i denatyruar dhe zakonisht përbëhet nga fenoli dhe izotiocianati i guanidinës.Për më tepër, frenuesit e RNase zakonisht janë të pranishëm në tamponin e lizës për të siguruar izolimin e ARN-së virale të paprekur.

Pas shtimit të tamponit të lizës, vorbulloni tubin e përzierjes me puls dhe inkuboni në temperaturën e dhomës.Virusi lizohet më pas në kushte shumë denatyruese të ofruara nga tamponi i lizës.

Pasi kampioni lizohet, përdoret një tub centrifuge për procedurën e pastrimit.Mostra ngarkohet në tubin e centrifugës dhe më pas centrifugohet.

Kjo procedurë është një metodë e nxjerrjes së fazës së ngurtë në të cilën faza e palëvizshme përbëhet nga një matricë silicë geli.

Në kushte optimale të kripës dhe pH, molekulat e ARN-së lidhen me membranën e silicës.

Në të njëjtën kohë, proteinat dhe ndotësit e tjerë hiqen.

Pas centrifugimit, vendoseni tubin e centrifugës në një tub të pastër grumbullimi, hidhni filtratin dhe më pas shtoni tampon larës.

Vendoseni tubin përsëri në centrifugë për të detyruar tamponin e larjes përmes membranës.Kjo do të heqë të gjitha papastërtitë e mbetura nga membrana, duke lënë vetëm ARN-në të lidhur me xhelin silicë.

Pasi të jetë larë kampioni, vendoseni tubin në një tub të pastër mikrocentrifuge dhe shtoni tampon elucionin.

Më pas centrifugohet për të detyruar tampon elucionin përmes membranës.Buferi i elucionit heq ARN-në virale nga kolona e rrotullimit dhe merr ARN të pastruar pa proteina, frenues dhe ndotës të tjerë.

HAPI 2

Koncentrat i përzier

Pas nxjerrjes së ARN-së virale, hapi tjetër është përgatitja e përzierjes së reaksionit për amplifikimin e PCR.Në këtë hap, përdoret koncentrati.Kjo tretësirë ​​e përqendruar është një tretësirë ​​e koncentruar e parapërzier e përbërë nga një parapërzierje, transkriptazë e kundërt, nukleotide, primer përpara, primer i kundërt, sondë TaqMan dhe polimerazë ADN.

Së fundi, për të përfunduar këtë përzierje të reaksionit, shtohet shablloni i ARN-së.Tubat përzihen me vorbullim pulsi, dhe më pas përzierja e reaksionit ngarkohet në pllakën PCR.Pllaka PCR zakonisht përmban 96 puse dhe mund të analizojë mostra të shumta në të njëjtën kohë.

HAPI 3

Amplifikimi PCR

Më pas, vendoseni pllakën në makinën PCR, e cila në thelb është një ciklues termik.

RT-PCR në kohë reale përdoret për të zbuluar koronavirusin e ri 2019 duke përforcuar sekuencën e synuar në gjenin RdrRP, gjenin E dhe gjenin N.Zgjedhja e gjenit të synuar varet nga sekuenca e primerit dhe e sondës.

Hapi i parë i RT-PCR është transkriptimi i kundërt.Sintetizohet vargu i parë i ADN-së komplementare, i cili inicohet nga primeri i kundërt PCR, i cili lidhet me pjesën komplementare të gjenomës së ARN-së virale.Pastaj transkriptaza e kundërt shton nukleotidet e ADN-së në fundin 3 të primerit për të sintetizuar ADN-në plotësuese të ARN-së virale.Temperatura dhe kohëzgjatja e këtij hapi varen nga primerët, ARN-ja e synuar dhe transkriptaza e kundërt e përdorur.

Më pas, zbatohet një hap fillestar denatyrimi, i cili rezulton në denatyrimin e hibridit ARN-ADN.Ky hap është i nevojshëm për të aktivizuar polimerazën e ADN-së.Në të njëjtën kohë, transkriptaza e kundërt çaktivizohet.

PCR përbëhet nga një seri ciklesh termike.Çdo cikël përbëhet nga hapat e denatyrimit, pjekjes dhe zgjatjes.

Hapi i denatyrimit përfshin ngrohjen e dhomës së reagimit në 95 gradë Celsius dhe përdorimin e saj për denatyrimin e shabllonit të ADN-së me dy vargje.

Në hapin tjetër, temperatura e reaksionit zvogëlohet në 58 gradë Celsius, duke lejuar abetaren e përparme të pjek në pjesën plotësuese të shabllonit të ADN-së me një fije floku.Temperatura e pjekjes varet drejtpërdrejt nga gjatësia dhe përbërja e abetares.

Në hapin e shtrirjes, polimeraza e ADN-së sintetizon një varg të ri të ADN-së që është plotësues me vargun e shabllonit të ADN-së.Duke shtuar bërthama të lira plotësuese për shabllonin në drejtimin 5' deri në 3' nga përzierja e reaksionit.Temperatura e këtij hapi varet nga ADN polimeraza e përdorur.

Pas ciklit të parë, merret një objektiv i ADN-së me dy fije.

Pastaj, hyni në ciklin e dytë.ADN-ja me dy zinxhirë denatyrohet për të prodhuar dy molekula të ADN-së me një zinxhir.

Në hapin tjetër, temperatura e reaksionit ulet, primerët kalohen në çdo shabllon të ADN-së me një fije floku dhe sonda Taq-man është pjekja në pjesën plotësuese të ADN-së së synuar.

Sonda TaqMan përbëhet nga një fluorofore e lidhur në mënyrë kovalente me skajin 5' të sondës oligonukleotide.Kur ngacmohet nga burimi i dritës së cikluesit, fluorofori lëshon fluoreshencë.Përveç kësaj, sonda është e përbërë nga një shuarës në fundin 3.Afërsia e gjenit raportues me shuarësin parandalon zbulimin e fluoreshencës.

Në hapin e shtrirjes, polimeraza e ADN-së sintetizon një varg të ri.Kur polimeraza arrin në sondën TaqMan, aktiviteti i saj endogjen 5'nukleazë e këput sondë, duke e ndarë ngjyrën nga shuesi.

Me çdo cikël të PCR, lëshohen më shumë molekula bojë, duke rezultuar në një rritje të intensitetit të fluoreshencës proporcionale me numrin e amplikoneve të sintetizuara.

Kjo metodë ju lejon të vlerësoni numrin e një sekuence të caktuar të pranishme në mostër.Numri i fragmenteve të ADN-së me dy zinxhirë dyfishohet në çdo cikël.Prandaj, PCR mund të përdoret për të analizuar mostra shumë të vogla.

Për matjen e sinjalit fluoreshent, llambën halogjene të tungstenit, filtrin e ngacmimit, reflektorin, lentet, filtrin e emetimit dhe kamerën CCD me pajisje të shoqëruar me karikimin.

HAPI 4 Zbuloni

Për matjen e sinjalit fluoreshent, llambën halogjene të tungstenit, filtrin e ngacmimit, reflektorin, lentet, filtrin e emetimit dhe kamerën CCD me pajisje të shoqëruar me karikimin.

Drita e filtruar nga llamba reflektohet nga reflektori, kalon përmes thjerrëzave të kondensatorit dhe fokusohet në qendër të çdo vrime.Pastaj fluoreshenca e emetuar nga vrima reflektohet nga pasqyra, kalon nëpër filtrin e emetimit dhe zbulohet nga kamera CCD.Në çdo cikël PCR, drita fluorofore e vetë-ngacmuar mund të zbulohet nga CCD.

Ai konverton dritën e kapur në të dhëna dixhitale.Kjo metodë quhet PCR në kohë reale dhe lejon monitorimin në kohë reale të ecurisë së reaksionit PCR.