Si një i ri në laborator, nuk është një punë e mirë për të ekzaminuar bimë pozitive nga një tufë bimësh me një shkallë të ulët konvertimi.Së pari, ADN-ja duhet të nxirret nga një numër i madh mostrash një nga një, dhe më pas gjenet e huaja do të zbulohen me PCR.Megjithatë, rezultatet janë shpesh bosh dhe breza me disa artikuj herë pas here, por është e pamundur të përcaktohet nëse ka zbulime të humbura ose zbulime të rreme..A është shumë e pafuqishme të përballesh me një proces dhe rezultat të tillë eksperimental?Mos u shqetësoni, vëllai ju mëson se si të kontrolloni bimët pozitive transgjenike me lehtësi dhe saktësi.

Hapi 1

Abetare për zbulimin e dizajnit

Përcaktoni gjenin endogjen dhe gjenin ekzogjen që do të zbulohet sipas mostrës që do të testohet dhe zgjidhni një sekuencë përfaqësuese 100-500 bp në gjenin për dizajnin e primerit.Primerët e mirë mund të sigurojnë saktësinë e rezultateve të zbulimit dhe të shkurtojnë kohën e zbulimit (shih shtojcën për primerët e zbulimit të përdorur zakonisht).

Shënim: Primerët e sapo projektuar duhet të optimizojnë kushtet e reagimit dhe të verifikojnë saktësinë, saktësinë dhe kufirin e zbulimit të zbulimit përpara zbulimit në shkallë të gjerë.

Hapi 2

Hartimi i protokollit eksperimental

Kontroll pozitiv: Përdorni ADN-në e pastruar që përmban fragmentin e synuar si shabllon për të përcaktuar nëse sistemi dhe kushtet e reagimit PCR janë normale.

Kontroll negativ/bosh: Përdorni shabllonin e ADN-së ose ddH2O që nuk përmban fragmentin e synuar si shabllon për të zbuluar nëse ka një burim kontaminimi në sistemin PCR.

Kontrolli i brendshëm i referencës: përdorni kombinimin primer/sondë të gjenit endogjen të kampionit që do të testohet për të vlerësuar nëse shablloni mund të zbulohet me PCR.

Njoftim:

Kontrollet pozitive, negative/bosh dhe kontrollet e kontrollit të brendshëm duhet të vendosen për çdo test për të vlerësuar vlefshmërinë e rezultateve eksperimentale.

Përgatitja e eksperimentit

Para përdorimit, shikoni nëse tretësira është përzier në mënyrë të barabartë.Nëse gjenden reshje, ato duhet të shpërndahen dhe të përzihen sipas udhëzimeve para përdorimit.Përzierja 2×PCR duhet të pipetohet dhe të përzihet në mënyrë të përsëritur me një mikropipetë përpara përdorimit për të shmangur shpërndarjen e pabarabartë të joneve.

Njoftim:

Nxirreni manualin dhe lexoni me kujdes dhe bëni përgatitjet përpara eksperimentit në përputhje të plotë me kërkesat e manualit.

Hapi 4

Përgatitni sistemin e reagimit PCR

Sipas protokollit eksperimental, përzieni primerët, H2O dhe 2×PCR përzieni në mënyrë të barabartë, centrifugoni dhe shpërndani në çdo tub reaksioni.

Njoftim:

Për testime në shkallë të gjerë ose afatgjatë, rekomandohet përdorimi i një sistemi reagimi PCR që përmban enzimën UNG, e cila mund të shmangë në mënyrë efektive ndotjen e aerosolit të shkaktuar nga produktet PCR.

Hapi 5

Shtoni shabllonin e reagimit

Duke përdorur teknologjinë Direct PCR, nuk ka nevojë për një proces të lodhshëm pastrimi të acidit nukleik, shablloni i mostrës mund të përgatitet brenda 10 minutave dhe mund të shtohet sistemi përkatës i reagimit PCR.

Njoftim:

Metoda e ndarjes ka efekt më të mirë zbulimi, dhe produkti i marrë mund të përdoret për reaksione të shumëfishta zbulimi.

5.1: Zgjerimi i drejtpërdrejtë i gjetheve

Sipas madhësisë së figurës në manual, prisni indin e gjethes me diametër 2-3 mm dhe vendoseni në sistemin e reagimit PCR.

Shënim: Sigurohuni që fragmentet e gjetheve të jenë zhytur plotësisht në tretësirën e reaksionit PCR dhe mos shtoni inde të tepërta gjethesh.

5.2: Metoda e ndarjes së gjetheve

Prisni indin e gjethes me diametër 5-7 mm dhe vendoseni në një tub centrifuge.Nëse zgjidhni gjethe të pjekura, ju lutemi shmangni përdorimin e indeve të damarit kryesor të gjethes.Hidhni me pipet 50 ul lizatë buffer P1 në një tub centrifuge për të siguruar që lizati mund të zhyt plotësisht indin e gjethes, vendoseni në një ciklues termik ose një banjë metalike dhe lizoni në 95°C për 5-10 minuta.

Shtoni 50 ul tretësirë ​​neutralizimi Buffer P2 dhe përzieni mirë.Lizati që rezulton mund të përdoret si shabllon dhe të shtohet në sistemin e reagimit PCR.

Shënim: Sasia e shabllonit është midis 5-10% e sistemit PCR dhe nuk duhet të kalojë 20% (për shembull, në një sistem PCR 20 μl, shtoni 1-2 μl tretësirë ​​lize, jo më shumë se 4 μl).

Hapi 6

Reagimi PCR

Pas centrifugimit të tubit të reaksionit PCR, ai vendoset në një instrument PCR për amplifikimin.

Njoftim:

Reaksioni përdor shabllon jo të pastruar për amplifikimin, kështu që numri i cikleve të amplifikimit është 5-10 cikle më shumë se kur përdoret shabllon i ADN-së së pastruar.

Hapi 7

Zbulimi i elektroforezës dhe analiza e rezultateve

M: 100bp ADN Ladder

1\4: Metoda e ADN-së e pastruar

2\5: Metoda e drejtpërdrejtë PCR

3\6: Kontrolli bosh

QC:

Rezultatet e testit të kontrolleve të ndryshme të vendosura në eksperiment duhet të plotësojnë kushtet e mëposhtme.Përndryshe, duhet të analizohet shkaku i problemit, dhe testi të bëhet sërish pasi të jetë eliminuar problemi.

Tabela 1. Rezultatet normale të testit të grupeve të ndryshme të kontrollit

*Kur plazmidi përdoret si kontroll pozitiv, rezultati i testit të gjenit endogjen mund të jetë negativ

Gjykimi i rezultatit:

A. Rezultati i testit të gjenit endogjen të kampionit është negativ, duke treguar se ADN-ja e përshtatshme për zbulimin e zakonshëm të PCR nuk mund të nxirret nga kampioni ose ADN-ja e nxjerrë përmban frenues të reaksionit PCR dhe ADN-ja duhet të nxirret sërish.

B. Rezultati i testit të gjenit endogjen të kampionit është pozitiv, dhe rezultati i testit të gjenit ekzogjen është negativ, që tregon se ADN-ja e përshtatshme për zbulimin e zakonshëm të PCR-së është nxjerrë nga kampioni dhe mund të gjykohet se gjeni XXX nuk është zbuluar në kampion.

C. Rezultati i testit të gjenit endogjen të kampionit është pozitiv, dhe rezultati i testit të gjenit ekzogjen është pozitiv, që tregon se ADN-ja e përshtatshme për zbulimin e zakonshëm të PCR-së është nxjerrë nga kampioni dhe ADN-ja e mostrës përmban gjenin XXX.Eksperimentet e konfirmimit mund të kryhen më tej.

Hapi 8

Abetare për zbulimin e dizajnit

Pas eksperimentit, përdorni 2% solucion hipoklorit natriumi dhe 70% zgjidhje etanoli për të fshirë zonën eksperimentale për të parandaluar ndotjen e mjedisit.