Vështrim i përgjithshëm
Identifikimi i shpejtë i bimëve transgjenike
Tekst/Tong Yucheng
Operacioni eksperimental/Han Ying
Redaktor/Wen Youjun
Fjalë/1600+
Koha e sugjeruar e leximit/8-10 minuta
Identifikimi i shpejtë i bimëve transgjenike
Si një i sapoardhur në laborator, nuk është një punë e mirë për të ekzaminuar bimë pozitive nga një grup bimësh me një shkallë të ulët konvertimi.Së pari, ADN-ja duhet të nxirret nga një numër i madh mostrash një nga një, dhe më pas gjenet e huaja do të zbulohen me PCR.Megjithatë, rezultatet janë shpesh bosh dhe breza me disa artikuj herë pas here, por është e pamundur të përcaktohet nëse ka zbulime të humbura ose zbulime të rreme..A është shumë e pafuqishme të përballesh me një proces dhe rezultat të tillë eksperimental?Mos u shqetësoni, vëllai ju mëson se si të kontrolloni bimët pozitive transgjenike me lehtësi dhe saktësi.
Hapi 1: Abetare për zbulimin e dizajnit
Përcaktoni gjenin endogjen dhe gjenin ekzogjen që do të zbulohet sipas mostrës që do të testohet dhe zgjidhni një sekuencë përfaqësuese 100-500 bp në gjenin për dizajnin e primerit.Primerët e mirë mund të sigurojnë saktësinë e rezultateve të zbulimit dhe të shkurtojnë kohën e zbulimit (shih shtojcën për primerët e zbulimit të përdorur zakonisht).
Shënim:
Primerët e projektuar rishtazi duhet të optimizojnë kushtet e reagimit dhe të verifikojnë saktësinë, saktësinë dhe kufirin e zbulimit të zbulimit përpara se të kryejnë zbulimin në shkallë të gjerë.
Hapi 2:Zhvilloni një protokoll eksperimental
Kontroll pozitiv: Përdorni ADN-në e pastruar që përmban fragmentin e synuar si shabllon për të përcaktuar nëse sistemi dhe kushtet e reagimit PCR janë normale.
Kontroll negativ/bosh: Përdorni një shabllon të ADN-së ose ddH2O që nuk përmban fragmentin e synuar si shabllon për të zbuluar nëse ka një burim kontaminimi në sistemin PCR.
Kontrolli i brendshëm i referencës: përdorni kombinimin primer/sondë të gjenit endogjen të kampionit që do të testohet për të vlerësuar nëse shablloni mund të zbulohet me PCR.
Shënim:
Kontrollet pozitive, negative/bosh dhe kontrollet e kontrollit të brendshëm duhet të vendosen për çdo test për të vlerësuar vlefshmërinë e rezultateve eksperimentale.
Hapi 3: Përgatitja e eksperimentit
Para përdorimit, shikoni nëse tretësira është përzier në mënyrë të barabartë.Nëse gjenden reshje, ato duhet të shpërndahen dhe të përzihen sipas udhëzimeve para përdorimit.Përzierja 2×PCR duhet të pipetohet dhe të përzihet në mënyrë të përsëritur me një mikropipetë përpara përdorimit për të shmangur shpërndarjen e pabarabartë të joneve.
Shënim:
Nxirrni udhëzimet dhe lexoni ato me kujdes dhe bëni përgatitjet para eksperimentit në përputhje të plotë me udhëzimet.
Hapi 4: Përgatitni sistemin e reagimit PCR
Sipas protokollit eksperimental, përzieni abetaret, H2O, 2×PCR përzihen, centrifugohen dhe shpërndahen në çdo tub reaksioni.
Shënim:
Për testime në shkallë të gjerë ose afatgjatë, rekomandohet përdorimi i një sistemi reagimi PCR që përmban enzimën UNG, e cila mund të shmangë në mënyrë efektive ndotjen e aerosolit të shkaktuar nga produktet PCR.
Hapi 5: Shtoni shabllonin e reagimit
Duke përdorur teknologjinë Direct PCR, nuk ka nevojë për një proces të lodhshëm pastrimi me acid nukleik.Modeli i mostrës mund të përgatitet brenda 10 minutash dhe të shtohet në sistemin përkatës të reagimit PCR.
Shënim:
Metoda Lysis ka një efekt më të mirë zbulues, dhe produkti i marrë mund të përdoret për reaksione të shumëfishta zbulimi.
5.1: PCR direkte e gjetheve
Sipas madhësisë së figurës në manual, prisni indin e gjethes me diametër 2-3 mm dhe vendoseni në sistemin e reagimit PCR.
Shënim: Sigurohuni që fragmentet e gjetheve të jenë zhytur plotësisht në tretësirën e reaksionit PCR dhe mos shtoni inde të tepërta gjethesh.
5.2: Metoda e lizës së gjetheve
Prisni indin e gjethes me diametër 5-7 mm dhe vendoseni në një tub centrifuge.Nëse zgjidhni gjethe të pjekura, ju lutemi shmangni përdorimin e indeve të damarit kryesor të gjethes.Hidhni me pipet 50 ul lizatë buffer P1 në një tub centrifuge për të siguruar që lizati mund të zhyt plotësisht indin e gjethes, vendoseni në një ciklues termik ose një banjë metalike dhe lizoni në 95°C për 5-10 minuta.
Shtoni 50 ul tretësirë neutralizimi Buffer P2 dhe përzieni mirë.Lizati që rezulton mund të përdoret si shabllon dhe të shtohet në sistemin e reagimit PCR.
Shënim: Sasia e shabllonit duhet të jetë ndërmjet 5-10% të sistemit PCR dhe nuk duhet të kalojë 20% (për shembull, në një sistem PCR 20 μl, shtoni 1-2 μl bufer lize, jo më shumë se 4 μl).
Hapi 6: Reagimi PCR
Pas centrifugimit të tubit të reagimit PCR, vendosini ato në një instrument PCR për amplifikimin.
Shënim:
Reaksioni përdor shabllon jo të pastruar për amplifikimin, kështu që numri i cikleve të amplifikimit është 5-10 cikle më shumë se kur përdoret shabllon i ADN-së së pastruar.
Hapi 7: Zbulimi i elektroforezës dhe analiza e rezultateve
M: 100bp ADN Shkallë
1\4: Metoda e ADN-së e pastruar
2\5: Metoda e drejtpërdrejtë PCR
3\6: Kontrolli bosh
Kontrolli i cilësisë:
Rezultatet e provës së kontrolleve të ndryshme të vendosura në eksperiment duhet të plotësojnë kushtet e mëposhtme.Përndryshe, duhet të analizohet shkaku i problemit, dhe testi të bëhet sërish pasi të jetë eliminuar problemi.
Tabela 1. Rezultatet normale të testit të grupeve të ndryshme të kontrollit
*Kur plazmidi përdoret si kontroll pozitiv, rezultati i testit të gjenit endogjen mund të jetë negativ
Gjykimi i rezultatit:
A. Rezultati i testit të gjenit endogjen të kampionit është negativ, duke treguar se ADN-ja e përshtatshme për zbulimin e zakonshëm të PCR nuk mund të nxirret nga kampioni ose ADN-ja e nxjerrë përmban frenues të reaksionit PCR dhe ADN-ja duhet të nxirret sërish.
B. Rezultati i testit të gjenit endogjen të kampionit është pozitiv, dhe rezultati i testit të gjenit ekzogjen është negativ, gjë që tregon se ADN-ja e përshtatshme për zbulimin e zakonshëm të PCR-së është nxjerrë nga kampioni dhe mund të gjykohet se gjeni XXX nuk është zbuluar në kampion.
C. Rezultati i testit të gjenit endogjen të kampionit është pozitiv, dhe rezultati i testit të gjenit ekzogjen është pozitiv, që tregon se ADN-ja e përshtatshme për zbulimin e zakonshëm PCR është nxjerrë nga kampioni dhe ADN-ja e mostrës përmban gjenin XXX.Eksperimentet e konfirmimit mund të kryhen më tej.
Hapi 8: Projektimi i abetareve të zbulimit
Pas eksperimentit, përdorni 2% solucion hipoklorit natriumi dhe 70% tretësirë etanoli për të fshirë zonën eksperimentale për të parandaluar ndotjen e mjedisit.
Shtojca
Tabela 2. Primerët e përdorur zakonisht për zbulimin e përgjithshëm PCR të bimëve të modifikuara gjenetikisht
Dokument referencë:
SN/T 1202-2010, Metoda cilësore e zbulimit të PCR për përbërësit e bimëve të modifikuara gjenetikisht në ushqim.
Njoftimi i Ministrisë së Bujqësisë 1485-5-2010, Testimi i përbërësve të bimëve të modifikuara gjenetikisht dhe produkteve të tyre-orizi M12 dhe derivatet e tij.
Koha e postimit: Qershor-09-2021
