一, Rritja e ndjeshmërisë së sistemit të reagimit:

1. Izoloni ARN me cilësi të lartë:

Sinteza e suksesshme cDNA vjen nga ARN me cilësi të lartë.ARN me cilësi të lartë duhet të paktën të jetë me gjatësi të plotë dhe pa frenues të transkriptazës së kundërt si EDTA ose SDS.Cilësia e ARN-së përcakton sasinë maksimale të informacionit të sekuencës që mund të transkriptoni në cDNA.Një metodë e zakonshme e pastrimit të ARN-së është një metodë me një hap që përdor izotiocianat guanidine/fenol acid.Për të parandaluar kontaminimin nga sasi të vogla të RNase, ARN-ja e izoluar nga mostrat e pasura me RNase (si pankreasi) duhet të ruhet në formaldehid për të ruajtur ARN me cilësi të lartë, veçanërisht për ruajtje afatgjatë.ARN-ja e nxjerrë nga mëlçia e miut në thelb u degradua pasi u ruajt në ujë për një javë, ndërsa ARN-ja e nxjerrë nga shpretka e minjve mbeti e qëndrueshme pasi u ruajt në ujë për 3 vjet.Përveç kësaj, transkriptet më të gjata se 4 kb janë më të ndjeshëm ndaj degradimit nga gjurmë RNase sesa transkriptet e vogla.Për të rritur qëndrueshmërinë e mostrave të ARN-së të ruajtura, ARN mund të shpërndahet në formamid të dejonizuar dhe të ruhet në -70°C.Formamidi i përdorur për të ruajtur ARN-në duhet të jetë pa mbetje degraduese të ARN-së.ARN nga pankreasi mund të ruhet në formamide për të paktën një vit.Kur përgatiteni për të përdorur ARN-në, mund të përdorni metodën e mëposhtme për të precipituar ARN-në: shtoni NaCl në 0.2M dhe 4 herë vëllimin e etanolit, vendoseni në temperaturën e dhomës për 3-5 minuta dhe centrifugoni në 10,000×g për 5 minuta.

2. Përdorni transkriptazën e kundërt RNaseH-joaktive (RNaseH-):

Frenuesit e RNase shpesh shtohen në reaksionet e transkriptimit të kundërt për të rritur gjatësinë dhe rendimentin e sintezës së cDNA.Frenuesit e RNase duhet të shtohen gjatë reaksionit të sintezës së vargut të parë në prani të një tamponi dhe një agjenti reduktues (siç është DTT), sepse procesi përpara sintezës së cDNA denatyron frenuesin, duke çliruar kështu RNazën e lidhur që mund të degradojë ARN-në.Frenuesit e proteinave RNase parandalojnë vetëm degradimin e ARN-së nga RNaza A, B, C dhe nuk parandalojnë RNazën në lëkurë, prandaj bëni kujdes që të mos futni RNase nga gishtat, pavarësisht përdorimit të këtyre frenuesve.

Transkriptaza e kundërt katalizon shndërrimin e ARN-së në cADN.Të dy M-MLV dhe AMV kanë aktivitet endogjen RNaseH përveç aktivitetit të tyre polimerazë.Aktiviteti i RNaseH dhe aktiviteti i polimerazës konkurrojnë me njëri-tjetrin për vargun hibrid të formuar midis shabllonit të ARN-së dhe primerit të ADN-së ose vargut zgjatues të cDNA, dhe degradojnë vargun e ARN-së në kompleksin ARN:ADN.Shablloni i ARN-së i degraduar nga aktiviteti RNaseH nuk mund të shërbejë më si një substrat efektiv për sintezën e cDNA, gjë që redukton rendimentin dhe gjatësinë e sintezës së cDNA.Prandaj, do të ishte e dobishme të eliminohej ose të zvogëlohej në masë të madhe aktiviteti RNaseH i transkriptazës së kundërt.

Transkriptaza e kundërt SuperScript Ⅱ, transkriptaza e kundërt RNaseH- MMLV dhe transkriptaza e kundërt thermoScript, RNaseH- AMV, mund të marrin më shumë sasi dhe cDNA më të gjatë se MMLV dhe AMV.Ndjeshmëria ndaj RT-PCR do të ndikohet nga sasia e sintezës së cDNA.ThermoScript është shumë më i ndjeshëm se AMV.Madhësia e produkteve RT-PCR është e kufizuar nga aftësia e transkriptazës së kundërt për të sintetizuar cDNA, veçanërisht kur klonohen cDNA më të mëdha.Krahasuar me MMLV, SuperScripⅡ rriti ndjeshëm rendimentin e produkteve të gjata RT-PCR.Transkriptaza e kundërt RNaseH gjithashtu ka një qëndrueshmëri të lartë termike, kështu që reagimi mund të kryhet në temperatura më të larta se normalja 37-42°C.Në kushtet e sugjeruara të sintezës, përdorni primer oligo(dT) dhe 10 μCi [α-P]dCTP.Rendimenti total i fijes së parë u llogarit duke përdorur metodën e precipitimit TCA.cDNA me gjatësi të plotë u analizua duke përdorur breza të renditur sipas madhësisë të prerë dhe të numëruar në një xhel agarozë alkaline.

3. Ngritni temperaturën e inkubacionit për transkriptimin e kundërt:

Një temperaturë më e lartë e inkubacionit ndihmon në hapjen e strukturës dytësore të ARN-së, duke rritur rendimentin e reaksionit.Për shumicën e shablloneve të ARN-së, inkubimi i ARN-së dhe abetareve në 65°C pa tampon ose kripë, i ndjekur nga ftohja e shpejtë në akull do të eliminojë shumicën e strukturave dytësore dhe do të lejojë lidhjen e primerëve.Megjithatë, disa shabllone ende kanë struktura dytësore, edhe pas denatyrimit të nxehtësisë.Përforcimi i këtyre shablloneve të vështirë mund të kryhet duke përdorur ThermoScript Reverse Transcriptase dhe vendosjen e reaksionit të transkriptimit të kundërt në një temperaturë më të lartë për të përmirësuar amplifikimin.Temperaturat më të larta të inkubacionit mund të rrisin gjithashtu specifikën, veçanërisht kur primerët specifikë të gjeneve (GSP) përdoren për sintezën e cDNA-së (shih Kapitullin 3).Nëse përdorni GSP, sigurohuni që Tm e primerëve të jetë e njëjtë me temperaturën e pritur të inkubacionit.Mos përdorni oligo(dT) dhe primerë të rastësishëm mbi 60°C.Primerët e rastësishëm kërkojnë inkubim në 25°C për 10 minuta përpara se të rriten në 60°C.Përveç përdorimit të një temperature më të lartë të transkriptimit të kundërt, specifika mund të përmirësohet gjithashtu duke transferuar drejtpërdrejt përzierjen ARN/primer nga temperatura e denatyrimit 65°C në temperaturën e inkubacionit të transkriptimit të kundërt dhe duke shtuar një përzierje reaksioni 2× të ngrohur paraprakisht (sinteza e fillimit të nxehtë të cDNA).Kjo qasje ndihmon në parandalimin e çiftimit të bazave ndërmolekulare që ndodh në temperatura më të ulëta.Ndërrimi i shumëfishtë i temperaturës që kërkohet për RT-PCR mund të thjeshtohet duke përdorur një ciklues termik.

Tth polimeraza termostabile vepron si ADN polimerazë në prani të Mg2+ dhe si ARN polimerazë në prani të Mn2+.Mund të mbahet i ngrohtë në një temperaturë maksimale prej 65°C.Sidoqoftë, prania e Mn2+ gjatë PCR zvogëlon besnikërinë, gjë që e bën polimerazën Tth më pak të përshtatshme për përforcim me saktësi të lartë, siç është klonimi i cDNA.Përveç kësaj, Tth ka efikasitet të ulët të transkriptimit të kundërt, gjë që redukton ndjeshmërinë dhe, meqenëse transkriptimi i kundërt dhe PCR mund të kryhen me një enzimë të vetme, reaksionet e kontrollit pa transkriptim të kundërt nuk mund të përdoren për të krahasuar produktet e amplifikimit të cDNA me ADN gjenomike kontaminuese.Produktet e amplifikimit u ndanë.

4. Aditivët që nxisin transkriptimin e kundërt:

Aditivët duke përfshirë glicerinë dhe DMSO i shtohen reaksionit të sintezës së fijes së parë, gjë që mund të zvogëlojë qëndrueshmërinë e acidit nukleik me dy fije dhe të zgjidhë strukturën dytësore të ARN-së.Mund të shtohet deri në 20% glicerinë ose 10% DMSO pa ndikuar në aktivitetin e SuperScript II ose MMLV.AMV gjithashtu mund të tolerojë deri në 20% glicerinë pa humbje të aktivitetit.Për të maksimizuar ndjeshmërinë e RT-PCR në reaksionin e transkriptimit të kundërt SuperScriptⅡ, glicerinë 10% mund të shtohet dhe inkubohet në 45°C.Nëse 1/10 e produktit të reaksionit të transkriptimit të kundërt i shtohet PCR, atëherë përqendrimi i glicerinës në reaksionin e amplifikimit është 0.4%, që nuk mjafton për të frenuar PCR.

5. Trajtimi RNaseH:

Trajtimi i reaksioneve të sintezës së cDNA me RNaseH para PCR mund të rrisë ndjeshmërinë.Për disa shabllone, mendohet se ARN në reaksionin e sintezës së cDNA parandalon lidhjen e produkteve të amplifikimit, në këtë rast trajtimi me RNaseH mund të rrisë ndjeshmërinë.Në përgjithësi, trajtimi RNaseH është i nevojshëm kur amplifikohen shabllone më të gjata të synuara të cDNA-së me gjatësi të plotë, të tilla si skeroza tuberoze II me kopje të ulët.Për këtë shabllon të vështirë, trajtimi RNaseH përmirësoi sinjalin e prodhuar nga SuperScript II ose cDNA e sintetizuar nga AMV.Për shumicën e reaksioneve RT-PCR, trajtimi me RNaseH është opsional, sepse hapi i denatyrimit të PCR në 95°C përgjithësisht hidrolizon ARN-në në kompleksin ARN:ADN.

6. Përmirësimi i metodës së zbulimit të ARN-së së vogël:

RT-PCR është veçanërisht sfiduese kur janë të disponueshme vetëm sasi të vogla të ARN-së.Glikogjeni i shtuar si bartës gjatë izolimit të ARN-së ndihmon në rritjen e rendimentit të mostrave të vogla.Glikogjen pa RNase mund të shtohet në të njëjtën kohë me shtimin e Trizolit.Glikogjeni është i tretshëm në ujë dhe mund të mbahet në fazën ujore me ARN për të ndihmuar precipitimin e mëvonshëm.Për mostrat më pak se 50 mg inde ose 106 qeliza të kultivuara, përqendrimi i rekomanduar i glikogjenit pa RNase është 250 μg/ml.

Shtimi i BSA i acetiluar në reaksionin e transkriptimit të kundërt duke përdorur SuperScript II mund të rrisë ndjeshmërinë, dhe për sasi të vogla të ARN-së, zvogëlimi i sasisë së SuperScript II dhe shtimi i 40 njësive të frenuesit nukleazë RNaseOut mund të rrisë nivelin e zbulimit.Nëse glikogjen përdoret në procesin e izolimit të ARN-së, rekomandohet të shtoni frenues BSA ose RNase kur përdorni SuperScript II për reaksionin e transkriptimit të kundërt.

二、Rritja e specifikës RT-PCR

1. Asinteza CND:

Sinteza e cDNA-së së vargut të parë mund të fillohet duke përdorur tre metoda të ndryshme, specifika relative e të cilave ndikon në sasinë dhe llojin e cADN-së të sintetizuar.

Metoda e primerit të rastësishëm ishte më pak specifike nga tre metodat.Primerët pjekjen në vende të shumta përgjatë transkriptit, duke gjeneruar cDNA të shkurtra, me gjatësi të pjesshme.Kjo metodë përdoret shpesh për të marrë sekuencat fundore 5' dhe për të marrë cDNA nga shabllonet e ARN-së me rajone të strukturës dytësore ose me vende përfundimi që nuk mund të replikohen nga transkriptaza e kundërt.Për të marrë cADN-në më të gjatë, raporti i primerëve ndaj ARN-së në çdo kampion ARN duhet të përcaktohet në mënyrë empirike.Përqendrimi fillestar i abetareve të rastësishëm varionte nga 50 në 250 ng për 20 μl reaksion.Meqenëse cDNA e sintetizuar nga ARN totale duke përdorur abetare të rastësishme është kryesisht ARN ribozomale, poli(A)+ARN në përgjithësi zgjidhet si shabllon.

Primerët oligo(dT) janë më specifikë se abetaret e rastësishëm.Ai hibridizohet me bishtin poli(A) që gjendet në skajin 3' të shumicës së mARN-ve eukariote.Për shkak se ARN-ja poli(A)+ është afërsisht 1% deri në 2% e ARN-së totale, sasia dhe kompleksiteti i cDNA-së është shumë më pak se sa me primerët e rastësishëm.Për shkak të specifikës së tij të lartë, oligo(dT) në përgjithësi nuk kërkon optimizimin e raportit të ARN-së me primerët dhe përzgjedhjen e poli(A)+.Rekomandohet përdorimi i 0.5μg oligo(dT) për sistem reaksioni 20μl.oligo(dT)12-18 është i përshtatshëm për shumicën e RT-PCR.Sistemi ThermoScript RT-PCR ofron oligo(dT)20 për shkak të stabilitetit më të mirë termik për temperaturat më të larta të inkubacionit.

Primerët specifikë të gjeneve (GSP) janë primerët më specifikë për hapin e transkriptimit të kundërt.GSP është një oligonukleotid antisens që mund të hibridizohet në mënyrë specifike me sekuencën e synuar të ARN-së, ndryshe nga primerët e rastësishëm ose oligo(dT), të cilat anulohen me të gjitha ARN-të.Të njëjtat rregulla të përdorura për projektimin e primerëve PCR zbatohen për projektimin e GSP në reaksionet e transkriptimit të kundërt.GSP mund të jetë i njëjti sekuencë si primeri i amplifikimit që anulohet në skajin më 3' të mARN-së, ose GSP mund të projektohet për të pjekur në rrjedhën e poshtme të primerit të amplifikimit të kundërt.Për disa subjekte të amplifikuar, më shumë se një primer antisens duhet të projektohet për RT-PCR të suksesshme sepse struktura sekondare e ARN-së së synuar mund të parandalojë lidhjen e primerit.Rekomandohet përdorimi i 1 pmol antisense GSP në një reaksion të sintezës së fijes së parë prej 20 μl.

2. Ngritni temperaturën e inkubacionit për transkriptimin e kundërt:

Për të përfituar plotësisht nga avantazhi i plotë i specifikës GSP, duhet të përdoret një transkriptazë e kundërt me termostabilitet më të lartë.Transkriptazat e kundërta termostabile mund të inkubohen në temperatura më të larta për të rritur ashpërsinë e reagimit.Për shembull, nëse një GSP pjek në 55°C, specifika e GSP nuk do të përdoret plotësisht nëse AMV ose M-MLV përdoren për transkriptim të kundërt me një rreptësi të ulët prej 37°C.Megjithatë, SuperScript II dhe ThermoScript mund të reagojnë në 50°C ose më lart, gjë që do të eliminojë produktet jo specifike të krijuara në temperatura më të ulëta.Për specifikë maksimale, përzierja ARN/primer mund të transferohet drejtpërdrejt nga temperatura e denatyrimit 65°C në temperaturën e inkubacionit të transkriptimit të kundërt dhe të shtohet në një përzierje reaksioni 2× të ngrohur paraprakisht (fillimi i nxehtë i sintezës së cDNA).Kjo ndihmon në parandalimin e çiftimit të bazave ndërmolekulare në temperatura të ulëta.Kalimet e shumta të temperaturës të kërkuara për RT-PCR mund të thjeshtohen duke përdorur një ciklues termik.

3. Redukton kontaminimin gjenomik të ADN-së:

Një vështirësi e mundshme që haset me RT-PCR është kontaminimi i ADN-së gjenomike në ARN.Përdorimi i një metode të mirë të izolimit të ARN-së, siç është reagenti Trizol, do të zvogëlojë sasinë e ADN-së gjenomike që kontaminon përgatitjen e ARN-së.Për të shmangur produktet që rrjedhin nga ADN-ja gjenomike, ARN-ja mund të trajtohet me DNase I të shkallës së amplifikimit për të hequr ADN-në kontaminuese përpara transkriptimit të kundërt.Tretja e DNase I u ndërpre duke inkubuar mostrat në 2.0 mM EDTA për 10 minuta në 65°C.EDTA mund të kelojë jonet e magnezit, duke parandaluar hidrolizën e ARN-së të varur nga joni i magnezit në temperatura të larta.

Për të ndarë cDNA-në e përforcuar nga produktet e amplifikimit të ADN-së gjenomike kontaminuese, mund të dizajnohen primerë që secili të anulojë për të ndarë ekzone.Produktet PCR që rrjedhin nga cDNA do të jenë më të shkurtra se ato që rrjedhin nga ADN-ja gjenomike e kontaminuar.Përveç kësaj, një eksperiment kontrolli pa transkriptim të kundërt u krye në çdo shabllon të ARN-së për të përcaktuar nëse një fragment i caktuar rrjedh nga ADN gjenomike ose cDNA.Produkti PCR i marrë pa transkriptim të kundërt rrjedh nga gjenomi.