Ⅰ. Rritja e ndjeshmërisë së sistemit të reagimit:
1. Ndani ARN me cilësi të lartë:
Sinteza e suksesshme cDNA vjen nga ARN me cilësi të lartë.ARN me cilësi të lartë duhet të sigurojë të paktën një total më të gjatë dhe nuk përmban frenues që nuk përmbajnë enzima regjistrimi, të tilla si EDTA ose SDS.Cilësia e ARN-së përcakton vlerën maksimale të informacionit të sekuencës që mund të transkriptoni në cDNA.Metoda e përgjithshme e pastrimit të ARN-së është një metodë hap pas përdorimit të izoocianatit/acidofenolit.Për të parandaluar ndotjen e RNase, ARN-ja e ndarë nga një kampion i pasur me RNase (si pankreasi) kërkon ruajtjen e formaldehidit për të kursyer ARN me cilësi të lartë, që është edhe më shumë për ruajtjen afatgjatë.ARN-ja e nxjerrë nga mëlçia e miut në thelb u degradua pas një jave të ruajtjes në ujë, ndërsa ARN-ja e nxjerrë nga shpretka e miut mbeti e qëndrueshme pas tre vitesh ruajtje në ujë.Përveç kësaj, transkriptet më të mëdha se 4kb janë më të ndjeshëm ndaj gjurmimit të degradimit të RNase sesa transkriptet e vogla.Për të rritur qëndrueshmërinë e kampionit të ARN-së së ruajtjes, ARN-ja mund të shpërndahet në një metalmamine joni dhe ruhet në -70 °C.Tilidi i përdorur për të shpëtuar ARN-në nuk duhet të përmbajë një objekt të ndryshëm që degradon ARN-në.ARN, e cila rrjedh nga pankreasi, mund të ruhet në metalmaminë për të paktën një vit.Kur të jeni gati të përdorni ARN-në, mund të përdorni metodat e mëposhtme për të precipituar ARN-në: shtoni NaCl në 0,2 m dhe 4 herë më shumë se vëllimi i etanolit, vendosni temperaturën e dhomës për 3-5 minuta dhe 10,000 × g centrifugale për 5 minuta.
2. Përdorni transkriptazën e kundërt pa aktivitet RNaseH (RNaseH-):
Frenuesit e RNase shpesh shtohen në reaksionet e transkriptimit të kundërt për të rritur gjatësinë dhe rendimentin e sintezës së cDNA.Frenuesi i RNase shtohet në reaksionin e parë të sintezës së zinxhirit në prani të tamponëve dhe agjentëve reduktues si DTT, sepse procesi i sintezës së cDNA-së denatyron frenuesin, duke lëshuar kështu RNaza të lidhura që degradojnë ARN-në.Frenuesi i proteinave RNase parandalon vetëm degradimin e ARN-së nga RNaza A, B, C dhe nuk parandalon RNase në lëkurë, ndaj duhet pasur kujdes që të mos futen RNase nga gishtat pavarësisht përdorimit të këtyre inhibitorëve.
Transkriptaza e kundërt katalizon shndërrimin e ARN-së në cDNA.Të dy M-MLV dhe AMV kanë aktivitet endogjen RNaseH përveç aktivitetit të tyre polimerazë.Aktiviteti i RNaseH konkurron me aktivitetin e polimerazës për vargjet heterozigote të formuara midis shablloneve të ARN-së dhe primerëve të ADN-së ose vargjeve zgjatuese të cDNA-së dhe degradon vargjet ARN: ARN në komplekset e ADN-së.Modelet e ARN-së të degraduara nga aktiviteti RNaseH nuk mund të përdoren më si substrate efektive për sintezën e cDNA, duke reduktuar rendimentin dhe gjatësinë e sintezës së cDNA.Kështu, eliminimi ose reduktimi i madh i aktivitetit RNaseH të transkriptazës së kundërt do të ishte me përfitim të madh.
Transkriptaza e kundërt SuperScriptⅡ, transkriptaza e kundërt MMLV e RNaseH- dhe transkriptaza e kundërt thermoScript, AMV e RNaseH- dhanë cDNA më të gjatë se MMLV dhe AMV.Ndjeshmëria ndaj RT-PCR ndikohet nga sasia e cDNA e sintetizuar.ThermoScript është shumë më i ndjeshëm se AMV.Madhësia e produkteve RT-PCR është e kufizuar nga aftësia e transkriptazës së kundërt për të sintetizuar cDNA, veçanërisht kur klonohen Cdna më të mëdha.Krahasuar me MMLV, SuperScripⅡ rriti ndjeshëm rendimentin e produkteve të gjata RT-PCR.Transkriptaza e kundërt e RNaseH-së gjithashtu rrit stabilitetin termik, kështu që reagimi mund të kryhet në temperatura më të larta se normalja 37-42℃.Në kushtet e sugjeruara të sintezës, u përdorën primerët oligo(dT) dhe 10μCi [alfa-p]dCTP.Prodhimi total i zinxhirit të parë u llogarit duke përdorur metodën e reshjeve TCA.cDNA me gjatësi të plotë u analizua duke përdorur heqjen e shiritave të renditur sipas madhësisë dhe numërimin në një xhel agaroze alkaline.
3. Rritni temperaturën e ruajtjes së nxehtësisë së transkriptimit të kundërt:
Temperatura më e lartë e mbajtjes ndihmon në hapjen e strukturës dytësore të ARN-së dhe rritjen e rendimentit të reaksionit.Për shumicën e shablloneve të ARN-së, mbajtja e ARN-së dhe primerit në 65°C pa tampon ose kripë dhe më pas ftohja e tyre shpejt në akull eliminon shumicën e strukturave dytësore dhe lejon lidhjen e primerëve.Megjithatë, disa shabllone ende kanë strukturë dytësore, edhe pas denatyrimit termik.Përforcimi i këtyre shablloneve të vështirë mund të kryhet duke përdorur transkriptazën e kundërt ThermoScript dhe duke e vendosur reaksionin e transkriptazës së kundërt në temperatura më të larta për të përmirësuar amplifikimin.Temperaturat më të larta të mbajtjes mund të rrisin gjithashtu specifikën, veçanërisht kur sinteza e cDNA kryhet duke përdorur primerë specifikë për gjenet (GSPS) (shih Kapitullin 3).Nëse përdorni GSP, sigurohuni që vlera Tm e primerit të jetë e njëjtë me temperaturën e pritur të mbajtjes.Mos përdorni oligo(dT) dhe primerë të rastësishëm mbi 60℃.Abetaret e rastësishme duhet të mbahen në 25℃ për 10 minuta përpara se të rriten në 60℃.Përveç përdorimit të temperaturave më të larta të transkriptimit të kundërt, specifika mund të përmirësohet duke transferuar drejtpërdrejt përzierjen e ARN/primerit nga temperatura e denatyrimit 65℃ në temperaturën e mbajtjes së transkriptimit të kundërt dhe duke shtuar një përzierje reaksioni 2× të paranxehur (sinteza e fillimit termik të cDNA).Kjo qasje ndihmon në parandalimin e çiftimit të bazave ndërmolekulare që ndodh në temperatura më të ulëta.Përdorimi i një instrumenti PCR thjeshton shumë çelsat e temperaturës që kërkohen për RT-PCR.
Tth polimeraza e stabilizuar me nxehtësi vepron si ADN polimerazë në prani të Mg2+ dhe ARN polimerazës në prani të Mn2+.Mund të mbajë nxehtësi deri në 65℃.Megjithatë, prania e Mn2+ gjatë PCR zvogëlon besnikërinë, gjë që e bën polimerazën Tth më pak të përshtatshme për amplifikimin me saktësi të lartë, siç është klonimi i cDNA.Përveç kësaj, Tth është më pak efikas në transkriptimin e kundërt, gjë që redukton ndjeshmërinë, dhe meqenëse një enzimë e vetme mund të kryejë transkriptimin e kundërt dhe PCR, reaksionet e kontrollit pa transkriptim të kundërt nuk mund të përdoren për të dalluar produktet e amplifikuara të cDNA nga ato të ADN-së gjenomike të kontaminuar.
4. Shtues që promovon transkriptimin e kundërt:
Shtimi i aditivëve, duke përfshirë glicerinë dhe DMSO, në reaksionin e parë të sintezës së zinxhirit mund të zvogëlojë stabilitetin e fijes së dyfishtë të acidit nukleik dhe të zbërthejë strukturën dytësore të ARN-së.Mund të shtohet deri në 20% glicerinë ose 10% DMSO pa ndikuar në aktivitetin e SuperScriptⅡ ose MMLV.AMV gjithashtu mund të tolerojë deri në 20% glicerinë pa reduktuar aktivitetin.Për të maksimizuar ndjeshmërinë e RT-PCR në reaksionin e transkriptimit të kundërt SuperScriptⅡ, mund të shtohet 10% glicerinë dhe të izolohet në 45℃.Nëse PCR-së i shtohet 1/10 e produktit të reaksionit të retrotranskriptimit, përqendrimi i glicerinës në reaksionin e amplifikimit është 0.4%, që nuk mjafton për të frenuar PCR.
5. Përpunimi RNaseH:
Ndjeshmëria mund të përmirësohet duke trajtuar reaksionet e sintezës së cDNA me RNaseH përpara PCR.Për disa shabllone, mendohet se ARN në reaksionin e sintezës së cDNA parandalon lidhjen e produkteve të përforcuara, në të cilin rast trajtimi RNaseH mund të rrisë ndjeshmërinë.Në përgjithësi, trajtimi RNaseH kërkohet për amplifikimin e një shablloni të synuar të cDNA-së me gjatësi të plotë relativisht të gjatë, siç është skeroza tuberozeⅡ me kopje të ulët.Për këtë shabllon të vështirë, RNaseH përmirësoi sinjalin e gjeneruar nga cDNA e sintetizuar nga SuperScriptⅡ ose AMV.Për shumicën e reaksioneve RT-PCR, trajtimi RNaseH është opsional sepse hapi i denatyrimit të PCR-së me izolim 95℃ zakonisht hidrolizon ARN-në nga kompleksi ARN: ADN.
6. Metoda të përmirësuara për zbulimin e sasive të vogla të ARN:
RT-PCR është veçanërisht sfiduese kur janë të disponueshme vetëm sasi të vogla të ARN-së.Shtimi i glikogjenit si bartës gjatë ndarjes së ARN-së ndihmon në rritjen e rendimentit të mostrave të vogla.Një glikogjen pa RNase mund të shtohet në të njëjtën kohë me Trizol.Glikogjeni është i tretshëm në ujë dhe mund të mbetet në fazën ujore me ARN për të ndihmuar në reshjet e mëvonshme.Përqendrimi i rekomanduar i glikogjenit pa RNase është 250 μg/ml për mostrat më pak se 50 mg inde ose 106 qeliza të kultivuara.
Shtimi i BSA i acetiluar në reaksionet e transkriptimit të kundërt duke përdorur SuperScriptⅡ mund të rrisë ndjeshmërinë, dhe për sasi të vogla të ARN-së, zvogëlimi i sasisë së SuperScriptⅡ dhe shtimi i 40 njësive të frenuesit nukleazë RnaseOut mund të përmirësojë nivelin e zbulimit.Nëse glikogjeni përdoret në ndarjen e ARN-së, rekomandohet ende shtimi i frenuesve BSA ose RNase për të kthyer reaksionet e transkriptimit duke përdorur SuperScriptⅡ.
Ⅱ. Rritja e specifikës së RT-PCR
1. Sinteza e cNDA:
Tre metoda të ndryshme mund të përdoren për të filluar sintezën e cDNA-së së vargut të parë, dhe specifika relative e secilës metodë ndikon në sasinë dhe llojin e cDNA-së të sintetizuar.
Metoda e abetares së rastësishme është më pak specifike nga tre metodat.Primerët janë pjekur në vende të shumta përgjatë transkriptit për të prodhuar cDNA të shkurtër me gjatësi të pjesshme.Kjo metodë përdoret shpesh për të marrë sekuencat terminale 5' dhe cDNA nga shabllonet e ARN-së me rajone strukturore dytësore ose me vende përfunduese që transkriptaza e kundërt nuk mund të përsëritet.Për të marrë cADN-në më të gjatë, raporti i primerëve ndaj ARN-së në çdo kampion ARN duhet të përcaktohet në mënyrë empirike.Përqendrimi fillestar i primerëve të rastësishëm varion nga 50 në 250 ng për 20 μl sistem reaksioni.Për shkak se cADN e sintetizuar nga ARN totale duke përdorur abetare të rastësishme është kryesisht ARN ribozomale, poli(A)+ARN në përgjithësi zgjidhet si shabllon.
Fillimi i oligo(dT) është më specifik sesa primerët e rastësishëm.Ai hibridizohet me bishtin poli(A) që gjendet në skajin 3' të mRNA në shumicën e qelizave eukariote.Për shkak se poli(A)+ARN është afërsisht 1% deri në 2% e ARN-së totale, sasia dhe kompleksiteti i cDNA-së është shumë më i vogël sesa nëse do të përdoreshin primerë të rastësishëm.Për shkak të specifikës së tij të lartë, oligo(dT) në përgjithësi nuk kërkon optimizim për raportin ARN ndaj primerit dhe përzgjedhjen e poli(A)+.Rekomandohet përdorimi i 0.5μg oligo(dT) për sistem reaksioni 20μl.oligo(dT)12-18 është i përshtatshëm për shumicën e RT-PCR.Sistemi ThermoScript RT-PCR ofron oligo(dT)20 për shkak të qëndrueshmërisë së tij të mirë termike dhe është i përshtatshëm për temperatura më të larta mbajtëse.
Primerët specifikë të gjeneve (GSP) janë primerët specifikë më të mirë për hapin e kundërt të transkriptimit.GSP është një oligonukleozid antisens që mund të hibridizohet në mënyrë specifike me sekuencat e destinacionit të ARN-së, në vend që të pjek të gjitha RNA-t si primerët e rastësishëm ose oligo(dT).Rregullat e përdorura për dizajnimin e primerëve PCR zbatohen gjithashtu për projektimin e reaksionit të transkriptimit të kundërt GSP.GSP mund të jetë e njëjta sekuencë si primeri i amplifikimit i pjekur në fund të mRNA3', ose GSP mund të projektohet për t'u pjekur në rrjedhën e poshtme me primerin e përforcimit të kundërt.Për disa objekte të amplifikuara, është e nevojshme të dizajnohet më shumë se një primer antisens për RT-PCR të suksesshme, sepse struktura sekondare e ARN-së së synuar mund të parandalojë lidhjen e primerit.Sugjerohet përdorimi i 1pmol antisense GSP në sistemin e parë të reaksionit të sintezës së zinxhirit prej 20 μl.
2. Rritni temperaturën e ruajtjes së nxehtësisë së transkriptimit të kundërt:
Për të përfituar plotësisht nga specifika e GSP, duhet të përdoret transkriptaza e kundërt me stabilitet të lartë termik.Transkriptaza e kundërt e qëndrueshme ndaj nxehtësisë mund të izolohet në temperatura më të larta për të rritur ashpërsinë e reagimit.Për shembull, nëse një GSP është pjekur në 55°C, atëherë specifika e GSP nuk përdoret plotësisht nëse transkriptimi i kundërt kryhet në 37°C me rigorozitet të ulët duke përdorur AMV ose M-MLV.Megjithatë, SuperScripⅡ dhe ThermoScript mund të reagojnë në 50℃ ose më lart, gjë që eliminon produktet jospecifike të prodhuara në temperatura më të ulëta.Për specifikën maksimale, përzierja ARN/primer mund të transferohet drejtpërdrejt nga temperatura e denatyrimit 65℃ në temperaturën e mbajtjes së transkriptimit të kundërt me shtimin e një përzierjeje reaksioni të paranxehur 2 x (fillimi termik i sintezës së cDNA).Kjo ndihmon në parandalimin e çiftimit të bazave midis molekulave në temperatura të ulëta.Përdorimi i një instrumenti PCR thjeshton shumë kalime të temperaturës që kërkohen për RT-PCR.
3. Zvogëloni kontaminimin gjenomik të ADN-së:
Një vështirësi e mundshme me RT-PCR është se ARN-ja kontaminon ADN-në gjenomike.Përdorimi i metodave më të mira të ndarjes së ARN-së, si Reagenti Trizol, redukton ndotjen gjenomike të ADN-së në preparatet e ARN-së.Për të shmangur produktet e prodhuara nga ADN-ja gjenomike, ARN-ja mund të trajtohet me klasën e amplifikimit DnasⅠ për të hequr ADN-në e kontaminuar përpara transkriptimit të kundërt.Mostrat u mbajtën në 65℃ në 2.0mM EDTA për 10 minuta për të përfunduar tretjen e DNaseⅠ.EDTA kelon jonet e magnezit për të parandaluar hidrolizën e ARN-së të varur nga jonet e magnezit që ndodh në temperatura të larta.
Për të ndarë cDNA-në e përforcuar nga produkti i amplifikimit të ADN-së së gjenomit, mund të dizajnohen primerë që pjekjen veçmas me ekzonin e ndarë.Produktet PCR që rrjedhin nga cDNA do të jenë më të shkurtra se ato që rrjedhin nga ADN-ja gjenomike e kontaminuar.Një eksperiment i kontrolluar pa transkriptim të kundërt kryhet gjithashtu në çdo shabllon të ARN-së për të përcaktuar nëse një fragment i caktuar është nga ADN-ja gjenomike ose cDNA.Produktet PCR të marra në mungesë të transkriptimit të kundërt rrjedhin nga gjenomi.
Produkt i lidhur
-Kit me një hap mundëson kryerjen e transkriptimit të kundërt dhe PCR në të njëjtin tub.Duhet vetëm të shtojë shabllon ARN, primerë specifikë PCR dhe ddH pa RNase2O.
-Analiza sasiore në kohë reale e ARN-së mund të kryhet shpejt dhe saktë.
-Kit përdor një reagent unik të transkriptimit të kundërt Foregene dhe Foregene HotStar Taq ADN Polymerase të kombinuar me një sistem unik reagimi për të përmirësuar në mënyrë efektive efikasitetin e amplifikimit dhe specifikën e reaksionit.
-Sistemi i optimizuar i reagimit bën që reagimi të ketë ndjeshmëri më të lartë zbulimi, stabilitet më të fortë termik dhe tolerancë më të mirë.
-Aftësia efikase për të hequr gDNA, e cila mund të heqë gDNA në shabllon brenda 2 minutash.
-Sistemi efikas i transkriptimit të kundërt, duhen vetëm 15 minuta për të përfunduar sintezën e cDNA-së së vargut të parë.
-Tabele komplekse: shabllonet me përmbajtje të lartë GC dhe strukturë komplekse dytësore mund të kthehen gjithashtu me efikasitet të lartë.
-Sistemi i transkriptimit të kundërt me ndjeshmëri të lartë, shabllonet e nivelit pg mund të marrin gjithashtu cDNA me cilësi të lartë.
-Sistemi i transkriptimit të kundërt ka stabilitet të lartë termik, temperatura optimale e reagimit është 42℃, dhe ende ka performancë të mirë të transkriptimit të kundërt në 50℃.
Koha e postimit: Mar-07-2023
