Këshilla për përmirësimin e rikuperimit të ngjitësit

1. Rritni ngarkesën e mostrës gjatë elektroforezës.

2. Përdorni tampon elektroforezë të sapo përgatitur.

3. Gjatë prerjes së ngjitësit, përpiquni të prisni vetëm ngjitësin me shirita për të reduktuar volumin e prerjes së ngjitësit: nuk keni nevojë për ngjitës me pak fragmente qëllimi, përndryshe do të ndikojë në shkallën e rikuperimit.

4. Pasi të keni shkrirë dy ose më shumë copa ngjitëse, përdorni një tub sado i madh të jetë vëllimi dhe transferojeni në të njëjtën kolonë.

5. Tretësira e shtuar në sol mund të jetë pak më shumë, e cila është më e favorshme për lidhjen e ADN-së me membranën, por në përgjithësi nuk i kalon 750ul.

6. Çelësi i rikuperimit të xhelit është lidhja e ADN-së në kolonë përmes përqendrimit të kripës, aciditetit (ngarkimit) dhe hidrofobisë së tretësirës në kolonë.Prandaj, nëse pH i tamponit të elektroforezës është shumë i lartë, solsit mund t'i shtohen 10 ul (pH 5.0, 3mol/L NaAC);për të kapur më mirë molekulat e ADN-së në membranë, 30% izopropanol mund të shtohet për t'u ngrohur në lëng pas tretjes së ngjitësit.

7. Përpara se të shtoni eluentin, lëreni kolonën në temperaturën e dhomës për disa minuta (rreth 10 minuta) që të avullojë plotësisht etanoli.

8. Së fundi, shtoni më pak eluent për të minimizuar volumin e rikuperimit.Përgjithësisht, për elucionin përdoret 30-50μl eluent (jo shumë pak, përndryshe nuk do të jetë në gjendje të lag membranën, e cila nuk është e favorshme për elucionin);pikat e elucionit janë në qendër të membranës, për të elutur plotësisht ADN-në e lidhur me membranën.

9. Pas shtimit të eluentit, mund të eluentohet në një banjë uji 55 gradë për 5 minuta ose të vendoset në një banjë uji 50 gradë për më shumë se 10 minuta, ose të mbyllet me një parafilm në 4 gradë gjatë natës dhe më pas të centrifugohet për rikuperim të nesërmen, efekti është i mirë.

10. Shtoni eluatin e centrifuguar përsëri në kolonën e adsorbimit dhe centrifugoni përsëri.

Metodat dhe procedurat e detajuara për rikuperimin e produktit PCR

1. Riciklimi i zakonshëm i gomës

Nëse dëshironi të rikuperoni ngjitësin, është mirë të përdorni një çantë, e cila është e përshtatshme dhe ka një shkallë pak më të lartë rikuperimi.Nëse vërtet duhet ta rikuperoni manualisht, mund të shtoni 3 herë vëllimin e TE pas prerjes së ngjitësit.Pas shkrirjes në një banjë uji, fenoli, fenoli/kloroformi nxirren pastër dhe etanoli precipitohet.Kjo eshte.

2. Rikuperimi i ADN-së nga xhel me pikë të ulët shkrirjeje

Pastrimi i Fragmenteve të ADN-së Shtoni TE (10 mmol/l Tris-HCl pH8.0, 0.1 mmol/l EDTA) e barabartë me vëllimin e xhelit dhe vendoseni në një banjë uji 65°C për 5 minuta që xheli të shpërndahet plotësisht.

Pasi u soll në temperaturën e dhomës, u shtua një sasi e barabartë fenoli (i ngopur me TE, TE u mbyll në shtresën e sipërme dhe shtresa e poshtme e fenolit u hoq) dhe përzierja u përzie lehtë (nuk kërkohet përzierje) dhe u centrifugua në 12,000 rpm për 3 minuta.Përsëriteni 1-2 herë.

Merrni supernatantin, shtoni 0,1 vëllim 3 mol/L acetat natriumi (pH 5,2) dhe 2,5 herë vëllimin e etanolit absolut për të kryer precipitimin e etanolit.Shpërndani ADN-në e pastruar me një sasi të përshtatshme TE, matni përmbajtjen dhe përgatituni për përdorim (mund të përdoret për analizën e strukturës së gjenit të synuar, përgatitjen e sondës, etj.).

3. Rikuperimi PCR me specifikë të mirë amplifikimi

Nëse specifika e amplifikimit PCR është e mirë, është thjesht një pastrim dhe rikuperim i thjeshtë i produktit PCR.Mund të shtoni 50 ug/ml proteinazë K në produktin PCR, 37 gradë për 1 orë, ekstraktoni një herë me fenol/kloroform, ekstraktoni një herë me kloroform dhe shtoni 0,1 vëllim të supernatantit.Acetati i natriumit u gjet me precipitim me 2.5 vëllime etanol absolut.

Produkte të ngjashme:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/