Transkriptazat e kundërta tradicionale nuk mund të tolerojnë temperatura të larta (temperatura optimale për aktivitetin e MMLV është 37-50°C dhe AMV është 42-60°C).ARN virale më komplekse nuk mund të transkriptohet në mënyrë efektive në cDNA në temperatura të ulëta, duke rezultuar në reduktimin e efikasitetit të zbulimit.RT-qPCR tradicionale në përgjithësi kërkon pjesëmarrjen e dy enzimave kryesore (transkriptaza e kundërt dhe ADN polimeraza), gjë që e bën të pamundur thjeshtimin e funksionimit të sistemit të reagimit dhe uljen e kostos.Këtu do të prezantojmë dy transkriptaza të kundërta rezistente ndaj temperaturës së lartë, TtH dhe RevTaq.Këto dy enzima kanë edhe funksionin e ADN polimerazës, ndaj quhen enzima dyfunksionale.

TtH ADN polimeraza

Ju duhet të keni dëgjuar për TtH, i cili rrjedh nga bakteri termofilik Thermus thermophilus HB8.Në prani të kationeve dyvalente si Mg2+, ka aktivitet polimerazë të ADN-së.Përdoret gjerësisht në reaksionet PCR si enzima Taq, por ka rezistencë më të lartë ndaj nxehtësisë sesa enzima Taq, kështu që gjithashtu ka një efekt më të mirë në PCR me shabllone me përmbajtje të lartë GC.

· Kjo enzimë në thelb nuk ka aktivitet ekzonukleazë 3'→5' dhe aktivitet ekzonukleazë 5'→3', kështu që mund të përdoret gjithashtu për renditjen e didoksi.

· Kjo enzimë ka aktivitet RTase.Në prani të Mn2+, aktiviteti RTase do të rritet.Duke përdorur këtë veçori, mund të përdoret për të kryer reaksionin e transkriptimit të kundërt dhe reagimin PCR në të njëjtin tub, domethënë RT-PCR me një hap.Megjithatë, në prani të Mn2+, saktësia e RT-PCR nuk është e lartë.Aktiviteti RT nuk ka asnjë lidhje me aktivitetin e rnaazës H.

· Rritja e aktivitetit të Tth-DNA polimerazës (pH9, optimale +55℃~70℃, maksimumi +95℃) kapërcen problemet e shkaktuara nga struktura sekondare e ARN-së.cDNA-ja që rezulton mund të përforcohet me PCR me të njëjtën enzimë në prani të joneve Mg2+.

· Aftësia e polimerazës Tth-DNA për të kryer transkriptimin e kundërt dhe amplifikimin e ADN-së në temperatura të larta e bën këtë enzimë të dobishme për RT-PCR sasiore, klonimin dhe analizën e shprehjes së gjeneve të ARN-së qelizore dhe virale.
· Polimeraza Tth-ADN përdoret për RT-PCR për të amplifikuar ARN deri në 1 kb.

Karakteristikat dhe avantazhet

Tth ADN polimeraza:

• Siguroni madhësinë e produktit të optimizuar të reaksionit zinxhir polimerazë (PCR), të paktën 1000 bp në reaksionin RT-PCR

• Pranoni trifosfatin deoksiribonukleozid të modifikuar si substrat

• Nuk lidhet me aktivitetin e RNazës H

• Ka qëndrueshmëri të lartë termike për të kapërcyer problemet, zakonisht të lidhura me strukturën e lartë dytësore të pranishme në ARN

RevTaq RT‐PCR ADN polimeraza

Një ADN polimerazë rezistente ndaj nxehtësisë me aktivitet të kundërt të transkriptazës

RevTaq-RT-PCR-DNA polimeraza është një enzimë e projektuar, shumë rezistente ndaj nxehtësisë, me funksion të dyfishtë, me aktivitete të transkriptazës së kundërt dhe ADN polimerazës të marra përmes evolucionit të drejtuar dhe artificial.

· Gjysma e jetës së RevTaq RT-PCR ADN polimerazës në 95°C është më e madhe se 40 minuta.

· RevTaq RT-PCR ADN polimeraza lejon transkriptimin e kundërt me temperaturë të lartë direkt nga shablloni i ARN-së dhe hapi i transkriptimit të kundërt mund të përsëritet disa herë për të gjeneruar më shumë shabllone cDNA.

· RevTaq RT-PCR ADN polimeraza lejon RT-PCR "zero-hap" (pa hap izotermik të transkriptimit të kundërt), sepse në hapin e zgjerimit ciklik të PCR, transkriptimi i kundërt dhe amplifikimi i ADN-së ndodhin njëkohësisht.Kjo gjithashtu nxit reagimin e kundërt të transkriptimit në temperatura të larta, duke minimizuar kështu problemet që hasen në shkrirjen e strukturës së fortë dytësore në ARN në temperatura të larta.

· Për shkak të formulës së fillimit të nxehtë me bazë aptamer, polimeraza e ADN-së RevTaq RT-PCR do të japë rezultate më të mira kur temperatura e pjekjes dhe e zgjatjes është më e lartë se 57°C.

· Meqenëse enzima është rezistente ndaj nxehtësisë, rekomandohet të projektohen primerë dhe sonda me pika shkrirjeje shumë të larta (>60°C).

· Rekomandohet të optimizoni temperaturën e hapit të pjekjes/zgjatjes përmes një gradienti të temperaturës gjatë procesit të konfigurimit të reaksionit.

· Sa më e lartë të jetë temperatura, aq më i lartë është specifika e PCR.Cikli i transkriptimit të kundërt zakonisht kryhet në një temperaturë më të lartë se cikli PCR, sepse hibridizimi i shabllonit të ADN Primer:ARN zakonisht ka një pikë shkrirje më të lartë se ADN Primer:cDNA Template dupleksi.

· RevTaq RT-PCR ADN polimeraza është e inxhinieruar dhe optimizuar gjenetikisht, dhe madhësia e amplikonit është midis 60-300 bp.

Kufiri i zbulimit të polimerazës së ADN-së RevTaq RT-PCR arrin në 4 kopje/

Sistemi i optimizuar i reagimit (vendosja e abetareve me pikë të lartë shkrirjeje) është paraqitur në figurë.RevTaq RT-PCR RT-PCR e drejtuar nga polimeraza e ADN-së tregon ndjeshmëri më të mirë se përzierja kryesore RT-qPCR me 1 hapi TaqPath dhe gradient hollimi i mostrës me zbulim më të ulët.

Më shumë avantazhe:

Funksioni i nisjes së shpejtë → Hapi fillestar i denatyrimit termik mund të anashkalohet.

Formula e aptamerit me startim të nxehtë → Siguroni 100% aktivitet enzimë menjëherë dhe parandaloni amplifikimin jospecifik në temperatura të ulëta (<57°C).

Funksioni i ndarjes → Hapi i nxjerrjes së ARN-së është lënë jashtë, sepse RevTaq RT-PCR ADN polimeraza mund të përpunojë gjithashtu mostrat e reaksionit të papërpunuar.Mund të shkatërrojë menjëherë membranat qelizore të eukarioteve, baktereve dhe viruseve në një cikël të nxehtë RT-PCR.

Niveli i lëndës së parë IVD → standarde të larta të cilësisë dhe çmime jashtëzakonisht konkurruese