• PCR është një metodë e përdorur për të amplifikuar ADN-në nga një sasi e vogël shablloni ADN-je.RT-PCR përdor transkriptimin e kundërt për të prodhuar një shabllon të ADN-së nga një burim ARN që më pas mund të përforcohet.
• PCR dhe RT-PCR janë zakonisht reaksione të pikës fundore, ndërsa qPCR dhe RT-qPCR përdorin kinetikën e shpejtësisë së sintezës së produktit gjatë reaksionit PCR për të përcaktuar sasinë e sasisë së shabllonit të pranishëm.
• Metodat më të reja, si PCR dixhitale, sigurojnë sasinë absolute të shabllonit fillestar të ADN-së, ndërsa metodat si PCR izotermale reduktojnë nevojën për pajisje të shtrenjta për të ofruar rezultate të besueshme.

Reaksioni zinxhir i polimerazës (PCR) është një teknikë relativisht e thjeshtë dhe e përdorur gjerësisht e biologjisë molekulare për të amplifikuar dhe zbuluar sekuencat e ADN-së dhe ARN-së.Krahasuar me metodat tradicionale të klonimit dhe amplifikimit të ADN-së, të cilat shpesh mund të zgjasin ditë, PCR kërkon vetëm disa orë.PCR është shumë e ndjeshme dhe kërkon shabllon minimal për zbulimin dhe amplifikimin e sekuencave specifike.Metodat bazë të PCR kanë avancuar më tej nga zbulimi i thjeshtë i ADN-së dhe ARN-së.Më poshtë, ne kemi dhënë një përmbledhje të metodave të ndryshme të PCR dhe reagentëve që ofrojmë në Enzo Life Sciences për nevojat tuaja kërkimore.Ne synojmë të ndihmojmë shkencëtarët të kenë qasje të shpejtë në reagentët PCR për t'i përdorur në projektin e tyre të ardhshëm kërkimor!

PCR

Për PCR standarde, gjithçka që ju nevojitet është një polimerazë e ADN-së, magnez, nukleotide, primerë, shabllonin e ADN-së që do të përforcohet dhe një termocikler.Mekanizmi i PCR është po aq i thjeshtë sa edhe qëllimi i tij: 1) ADN-ja me dy fije (dsDNA) është e denatyruar nga nxehtësia, 2) primerët rreshtohen me vargjet e vetme të ADN-së dhe 3) primerët zgjerohen nga ADN polimeraza, duke rezultuar në dy kopje të vargu origjinal i ADN-së.Procesi i denatyrimit, pjekjes dhe zgjatjes gjatë një sërë temperaturash dhe kohësh njihet si një cikël amplifikimi (Fig. 1).

Çdo hap i ciklit duhet të optimizohet për shabllonin dhe grupin e primerit të përdorur.Ky cikël përsëritet afërsisht 20-40 herë, dhe produkti i përforcuar mund të analizohet më pas, zakonisht me xhel agarozë (Fig. 2).

Meqenëse PCR është një metodë shumë e ndjeshme dhe nevojiten vëllime shumë të vogla për reaksione të vetme, rekomandohet përgatitja e një përzierjeje master për disa reaksione.Përzierja kryesore duhet të përzihet mirë dhe më pas të ndahet sipas numrit të reaksioneve, duke siguruar që çdo reaksion do të përmbajë të njëjtën sasi enzimash, dNTP dhe abetaresh.Shumë furnizues, si Enzo Life Sciences, ofrojnë gjithashtu përzierje PCR që tashmë përmbajnë gjithçka përveç primerëve dhe shabllonit të ADN-së.

Rajonet e pasura me guaninë/citozinë (të pasura me GC) përfaqësojnë një sfidë në teknikat standarde të PCR.Sekuencat e pasura me GC janë më të qëndrueshme se sekuencat me përmbajtje më të ulët GC.Për më tepër, sekuencat e pasura me GC kanë tendencë të formojnë struktura dytësore, të tilla si sythe të kapëseve të flokëve.Si rezultat, fijet e dyfishta të pasura me GC janë të vështira për t'u ndarë plotësisht gjatë fazës së denatyrimit.Rrjedhimisht, ADN polimeraza nuk mund të sintetizojë pa pengesë vargun e ri.Një temperaturë më e lartë e denatyrimit mund ta përmirësojë këtë dhe rregullimet drejt një temperature më të lartë pjekjeje dhe një kohe më të shkurtër pjekjeje mund të parandalojnë lidhjen jospecifike të primerëve të pasur me GC.Reagentët shtesë mund të përmirësojnë amplifikimin e sekuencave të pasura me GC.DMSO, glicerina dhe betaina ndihmojnë në prishjen e strukturave dytësore që shkaktohen nga ndërveprimet GC dhe në këtë mënyrë lehtësojnë ndarjen e fijeve të dyfishta.

Hot Start PCR

Amplifikimi jospecifik është një problem që mund të ndodhë gjatë PCR.Shumica e polimerazave të ADN-së që përdoren për PCR funksionojnë më mirë në temperaturat rreth 68°C deri në 72°C.Sidoqoftë, enzima mund të jetë aktive edhe në temperatura më të ulëta, megjithëse në një shkallë më të ulët.Në temperatura shumë nën temperaturën e pjekjes, primerët mund të lidhen në mënyrë jo specifike dhe të çojnë në përforcim jo specifik, edhe nëse reaksioni është vendosur në akull.Kjo mund të parandalohet duke përdorur frenuesit e polimerazës që shkëputen nga polimeraza e ADN-së vetëm pasi të arrihet një temperaturë e caktuar, prandaj termi PCR i fillimit të nxehtë.Frenuesi mund të jetë një antitrup që lidh polimerazën dhe denatyrohet në temperaturën fillestare të denatyrimit (95°C zakonisht).

Polimerazë me besueshmëri të lartë

Ndërsa polimerazat e ADN-së amplifikohen me mjaft saktësi në sekuencën origjinale të shabllonit, mund të ndodhin gabime në përputhjen e nukleotideve.Mospërputhjet në aplikacione të tilla si klonimi mund të rezultojnë në transkripte të cunguara dhe proteina të përkthyera gabim ose joaktive në rrjedhën e poshtme.Për të shmangur këto mospërputhje, polimerazat me një aktivitet "korrektues" janë identifikuar dhe inkorporuar në rrjedhën e punës.Polimeraza e parë korrigjuese, Pfu, u identifikua në 1991 në Pyrococcus furiosus.Kjo enzimë Pfu ka një aktivitet ekzonukleazë 3' deri në 5'.Ndërsa ADN-ja amplifikohet, ekzonukleaza heq nukleotidet e papërputhshme në skajin 3' të vargut.Më pas nukleotidi i saktë zëvendësohet dhe sinteza e ADN-së vazhdon.Identifikimi i sekuencave të pasakta të nukleotideve bazohet në afinitetin e lidhjes për trifosfatin e duhur nukleozid me enzimën, ku lidhja joefikase ngadalëson sintezën dhe lejon zëvendësimin e duhur.Aktiviteti korrigjues i polimerazës Pfu rezulton në më pak gabime në sekuencën përfundimtare në krahasim me polimerazën e ADN-së Taq.Vitet e fundit, janë identifikuar enzima të tjera korrigjuese dhe janë bërë modifikime të enzimës origjinale Pfu për të reduktuar më tej shkallën e gabimit gjatë amplifikimit të ADN-së.

RT-PCR

PCR e transkriptimit të kundërt, ose RT-PCR, lejon përdorimin e ARN-së si shabllon.Një hap shtesë lejon zbulimin dhe amplifikimin e ARN-së.ARN transkriptohet anasjelltas në ADN plotësuese (cDNA), duke përdorur transkriptazën e kundërt.Cilësia dhe pastërtia e shabllonit të ARN-së janë thelbësore për suksesin e RT-PCR.Hapi i parë i RT-PCR është sinteza e një hibridi ADN/ARN.Transkriptaza e kundërt ka gjithashtu një funksion RNase H, i cili degradon pjesën e ARN-së të hibridit.Më pas, molekula e ADN-së me një zinxhir plotësohet nga aktiviteti i polimerazës së ADN-së të varur nga ADN-ja e transkriptazës së kundërt në cADN.Efikasiteti i reaksionit të fijes së parë mund të ndikojë në procesin e amplifikimit.Prej këtu e tutje, procedura standarde PCR përdoret për të amplifikuar cDNA.Mundësia për të kthyer ARN-në në cDNA me anë të RT-PCR ka shumë përparësi dhe përdoret kryesisht për analizën e shprehjes së gjeneve.ARN është me një zinxhir dhe shumë të paqëndrueshme, gjë që e bën të vështirë punën me të.Zakonisht shërben si hapi i parë në qPCR, i cili përcakton sasinë e transkripteve të ARN-së në një kampion biologjik.

qPCR dhe RT-qPCR

PCR sasiore (qPCR) përdoret për të zbuluar, karakterizuar dhe përcaktojë sasinë e acideve nukleike për aplikime të shumta.Në RT-qPCR, transkriptet e ARN-së shpesh përcaktohen duke i transkriptuar ato në cDNA fillimisht, siç përshkruhet më sipër, dhe më pas kryhet qPCR.Ashtu si në PCR standarde, ADN-ja përforcohet nga tre hapa të përsëritur: denatyrimi, pjekja dhe zgjatja.Megjithatë, në qPCR, etiketimi fluoreshent mundëson mbledhjen e të dhënave ndërsa PCR përparon.Kjo teknikë ka shumë përfitime për shkak të gamës së metodave dhe kimikateve të disponueshme.

Në qPCR me bazë ngjyre (zakonisht jeshile), etiketimi fluoreshent lejon përcaktimin sasior të molekulave të ADN-së të përforcuar duke përdorur përdorimin e një ngjyre lidhëse dsDNA.Gjatë çdo cikli matet fluoreshenca.Sinjali i fluoreshencës rritet proporcionalisht me sasinë e ADN-së së përsëritur.Prandaj, ADN-ja përcaktohet në "kohë reale" (Fig. 3).Disavantazhet e qPCR me bazë ngjyre janë se vetëm një objektiv mund të ekzaminohet në të njëjtën kohë dhe se boja do të lidhet me çdo ds-ADN të pranishme në mostër.

Në qPCR të bazuar në sondë, shumë objektiva mund të zbulohen njëkohësisht në çdo kampion, por kjo kërkon optimizimin dhe dizajnimin e një sonde(s) specifike për objektivin e përdorur përveç primerëve.Ekzistojnë disa lloje të modeleve të sondës, por lloji më i zakonshëm është një sondë hidrolize, e cila përfshin një fluorofor dhe shues.Transferimi i energjisë me rezonancë fluoreshence (FRET) parandalon emetimin e fluoroforit nëpërmjet shuesit ndërsa sonda është e paprekur.Megjithatë, gjatë reaksionit PCR, sonda hidrolizohet gjatë shtrirjes së primerit dhe amplifikimit të sekuencës specifike me të cilën është e lidhur.Ndarja e sondës ndan fluoroforin nga shuesi dhe rezulton në një rritje të fluoreshencës të varur nga amplifikimi (Fig. 4).Kështu, sinjali i fluoreshencës nga një reagim qPCR i bazuar në sondë është proporcional me sasinë e sekuencës së synuar të sondës të pranishme në mostër.Për shkak se qPCR e bazuar në sondë është më specifike se qPCR e bazuar në ngjyrë, shpesh është teknologjia e përdorur në analizat diagnostike të bazuara në qPCR.

Amplifikimi izotermik

Teknikat PCR të përmendura më sipër kërkon pajisje të shtrenjta termociklimi për të rritur me saktësi temperaturat e dhomës për hapat e denatyrimit, pjekjes dhe zgjatjes.Janë zhvilluar një sërë teknikash që nuk kanë nevojë për pajisje kaq të sakta dhe mund të kryhen në një banjë të thjeshtë uji apo edhe brenda qelizave të interesit.Këto teknika quhen kolektivisht amplifikimi izotermik dhe punojnë në bazë të amplifikimit eksponencial, linear ose kaskadë.

Lloji më i njohur i amplifikimit izotermik është amplifikimi izotermik i ndërmjetësuar me lak, ose LAMP.LAMP përdor amplifikimin eksponencial në 65⁰C për të amplifikuar ADN-në ose ARN-në e shabllonit.Gjatë kryerjes së LAMP, katër deri në gjashtë primerë plotësues të rajoneve të ADN-së së synuar përdoren me një polimerazë të ADN-së për të sintetizuar ADN-në e re.Dy prej këtyre abetareve kanë sekuenca plotësuese që njohin sekuencat në primerët e tjerë dhe i lidhin ato, duke lejuar që të formohet një strukturë "lak" në ADN-në e sintetizuar rishtazi që më pas ndihmon pjekjen e primerit në raundet e mëvonshme të amplifikimit.LAMP mund të vizualizohet me metoda të shumta, duke përfshirë fluoreshencën, elektroforezën e xhelit të agarozës ose kolorimetrinë.Lehtësia e vizualizimit dhe zbulimit të pranisë ose mungesës së produktit nga kolorimetria dhe mungesa e pajisjeve të shtrenjta të kërkuara e bënë LAMP një opsion të përshtatshëm për testimin SARS-CoV-2 në zonat ku testimi laboratorik klinik nuk ishte i disponueshëm ose ruajtja dhe transporti i mostrave. nuk ishte e realizueshme, ose në laboratorë që më parë nuk kishin pajisje termociklike PCR.