RNase është një fjalë e ndjeshme që shumë studentë që shpesh kryejnë eksperimente të nxjerrjes së ARN-së nuk duan ta dëgjojnë.E armatosur plotësisht, ARN-ja që u nxor në fund me reagentët shumë toksikë fenol dhe kloroform u degradua.Unë nuk jam i pajtuar!!!Sot, le t'i hedhim një sy origjinës së Rnase së famshme.

Ribonukleaza (RNase), ose RNase, është një nukleazë që mund të hidrolizojë ARN-në në molekula të vogla.RNaza, si një proteinë me molekulë të vogël, është jashtëzakonisht e qëndrueshme .Sterilizimi konvencional me temperaturë të lartë dhe presion të lartë me avull dhe frenuesit e proteinave nuk mund ta çaktivizojnë plotësisht atë.Stabiliteti i RNase vjen kryesisht nga lidhjet disulfide në strukturë.Për shembull, RNaza e përdorur zakonisht e pankreasit të gjedhit ka vetëm 124 aminoacide, por përmban 4 lidhje disulfide.Lidhja squfuri dhe lidhja disulfide i japin RNase një stabilitet të shkëlqyer termik.Përveç kësaj, rnase ka një peshë molekulare relativisht të vogël dhe mund të rivendosë shpejt konformimin e saj origjinal në shumë raste.

Përveçse është jashtëzakonisht e qëndrueshme,RNazat janë të kudondodhura në laborator .RNase është një mekanizëm biologjik mbrojtës.Për një qelizë, ARN ekzogjene është shpesh fatale.Krahasuar me ADN-në ekzogjene, ARN-ja ekzogjene është shpesh më e rrezikshme.ARN transkriptohet dhe përkthehet me kënaqësi, kështu që pothuajse të gjithë organizmat kanë evoluar RNase për t'u mbrojtur kundër pushtimit të ARN ekzogjene.Prandaj, qelizat bakteriale të kultivuara në laborator dhe ju që nxirrni ARN nxjerrin aromën e RNase.Lëngjet e trupit të njeriut (pështyma, lotët, etj.) përmbajnë një sasi të madhe të RNase, prandaj mos qani kur ARN degradohet.Sa më shumë të qani, aq më keq është degradimi i ARN-së!!Motra Daiyu nuk është e përshtatshme për nxjerrjen e ARN-së!

Përveç kësaj, lëkura juaj delikate përmban gjithashtu shumë RNase dhe shënuesit, pipetat, dyert e frigoriferit dhe dorezat e dyerve që janë prekur nga lëkura gjithashtu përmbajnë RNase.

Me kaq shumë zhurmë, le të hedhim një vështrim se si të merremi me RNase.

Gjëja e parë që të gjithë mendojnë kur heqin ARN-në ështëDEPC(pirokarbonat dietil).DEPC denatyron kryesisht proteinën duke u kombinuar me unazën e imidazolit të histidinës së grupit aktiv të RNase, duke frenuar kështu aktivitetin e enzimës.0.1% DEPC mund të ketë një efekt më të mirë heqës ndaj Rnase, por duhet t'i kushtojmë vëmendje që DEPC është një kancerogjen i njohur, ndaj duhet kushtuar vëmendje e veçantë gjatë përdorimit të tij.

Për RNase, duhet të fillojmë nga dy aspekte,e para është frenimi i aktivitetit të RNazës endogjene

Reagjentët konvencionalë të ekstraktimit të ARN-së si guanidina izotiocianati dhe DTT që përmbahen në Trizol mund të hapin lidhjen disulfide të RNase, por ka ende disa RNase, veçanërisht në mostrat e indeve, prandaj kushtojini vëmendje temperaturës së ulët.

1.Zhytni menjëherë kampionin e indit në azot të lëngshëm pasi ta nxirrni jashtë ose në një zgjidhje komerciale për ruajtjen e ARN-së.

2.Pasi të keni nxjerrë ARN-në e kampionit të qelizës, shtoni atë në tretësirën e lizës dhe lijeni atë në kutinë e akullit.

3. Është mirë të përdoret azot i lëngshëm për bluarje kur mostrat e indeve homogjenizohen.Kur përdorni një homogjenizues elektrik pa azot të lëngshëm, kushtojini vëmendje ftohjes së plotë të përshtatësit homogjen.

E dyta është DNaza ekzogjene

1.Bëhuni plotësisht të armatosur, vishni një pallto laboratori, vishni një maskë dhe sigurohuni që të vishni një palë doreza të reja (mos u bëni kaq kursimtar!! Duhet të theksohet se Trizol është super gërryes, dhe gjithashtu është shumë i fortë përmes dorezave, prandaj mos u pikoni në duar).

2.Të gjitha majat e pipetës së përdorur, tubat EP, tubat PCR dhe pajisjet e tjera duhet të trajtohen me de-RNase.Mund të ngjyhet në 0.1% DEPC dhe më pas të vendoset nën presion nën presion të lartë.Kushtojini vëmendje funksionimit në një kapak tymi.Tiranët vendas mund të blejnë drejtpërdrejt materiale harxhuese për heqjen e enzimave.

PS: Më lejoni t'ju them një metodë dembel.Megjithëse temperatura e lartë dhe presioni i lartë nuk mund të heqin plotësisht RNase, ajo do të heqë një pjesë të madhe të saj.2 herë temperatura e lartë dhe presioni i lartë ka një efekt të mirë, dhe nxjerrja e ARN-së ka pak efekt.

3.Alkooli mund të denatyrojë proteinat,kështu që tabela e nxjerrjes së ARN-së mund të fshihet me 75% alkool , dhe dorezat gjithashtu mund të spërkaten me alkool.

4.Solucioni përfundimtar i tretjes së ARN-së dhe tubi i centrifugës duhet gjithashtu të trajtohen me de-RNase.Uji DEPC është një solucion tretës i ARN-së i përdorur zakonisht.Le të flasim për metodën e saktë të përgatitjes së ujit DEPC (mos harroni të ripaketoni DEPC-në komerciale kur ta blini atë)

Shtoni DEPC në ujin ultra të pastër në orën 1:1000, tundeni mirë, lëreni të qëndrojë gjatë natës në 37°C dhe sterilizoni në 121°C nën temperaturë të lartë dhe presion të lartë për 15 minuta.Uji DEPC mund të ruhet në -20°C në sasi prej 1 ml.

Së fundi, për të përmbledhur: temperatura e ulët është çelësi, materialet harxhuese trajtohen mirë, plotësisht të armatosura dhe më pak flasin!

Epo, kjo është ajo për strategjinë e sotme.Ju uroj gjithë përqendrimin dhe pastërtinë e ARN-së që përmendët.Të dy A260/A280 janë 2.0!!!

Sigurisht, nëse përdorni njëKompleti i nxjerrjes së ARN-së për funksionimin në temperaturën e dhomës, mund të mos hasni telashet e mësipërme.

Operacioni në temperaturën e dhomës, pa shtuar DNase, nxjerr ARN totale nga qelizat në 11 minuta dhe nxjerr ARN totale nga indet e kafshëve ose bimët në 30 minuta.

Për mostrat e provës, ju lutemi kontaktoni:overseas@foregene.com

Produkte të ngjashme:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/