Në eksperimentet qPCR, dizajni i primerit është gjithashtu një lidhje shumë e rëndësishme.Nëse primerët janë të përshtatshëm apo jo, lidhet ngushtë me faktin nëse efikasiteti i amplifikimit arrin standardin, nëse produktet e përforcuara janë specifike dhe nëse rezultatet eksperimentale janë të disponueshme.
Pra, si ta përmirësojmë specifikën e primerit qPCR?Efikasitet i lartë përforcues?
Sot, ne do t'ju çojmë të hartoni së bashku primerat qPCR dhe do ta lëmë dizajnin e primerit qPCR të bëhet një aftësi efiçente e njohurive në eksperimente.
Gjatë projektimit të primerëve qPCR, zakonisht i kushtoni vëmendje pikave të mëposhtme: primerët duhet të projektohen sa më shumë që të jetë e mundur nëpër introne, gjatësia e produktit duhet të jetë 100-300 bp, vlera e Tm duhet të jetë sa më afër 60°C, dhe primerët në rrjedhën e sipërme dhe të poshtme duhet të jenë sa më afër që të jetë e mundur, dhe fundi i primerit duhet të jetë G ose C, etj.
1. Projektimi i abetareve që përfshijnë introne
Gjatë dizajnimit të primerëve qPCR, zgjedhja e primerëve të dizajnuar nëpër introne mund të parandalojë amplifikimin e shabllonit të gDNA dhe të gjitha produktet rrjedhin nga amplifikimi i cDNA, duke eliminuar kështu ndikimin e kontaminimit të gDNA.
2. Gjatësia e abetares
Gjatësia e primerit është përgjithësisht midis 18-30 nt dhe gjatësia e produktit të amplifikimit duhet të kontrollohet midis 100-300 bp sa më shumë që të jetë e mundur.
Nëse primeri është shumë i shkurtër, do të çojë në përforcim jo specifik, dhe nëse është shumë i gjatë, do të formojë lehtësisht strukturë dytësore (siç është struktura e fijeve).Nëse produkti i amplifikimit është shumë i gjatë, ai nuk është i përshtatshëm për reaksionin e polimerazës, gjë që do të ndikojë në efikasitetin e amplifikimit PCR.
3. Përmbajtja GC dhe vlera Tm
Përmbajtja GC e primerëve duhet të kontrollohet ndërmjet 40% dhe 60%.Nëse është shumë e lartë ose shumë e ulët, nuk është e favorshme për fillimin e reagimit.Përmbajtja GC e primerit të përparmë dhe të kundërt duhet të jetë afërsisht e njëjtë për të marrë të njëjtën vlerë Tm dhe temperaturë të pjekjes.
Vlera e Tm duhet të jetë ndërmjet 55-65°C sa më shumë që të jetë e mundur, përgjithësisht rreth 60°C, dhe vlera e Tm në rrjedhën e sipërme dhe të poshtme duhet të jetë sa më afër që të jetë e mundur, mundësisht jo më shumë se 4°C.
4. Shmangni zgjedhjen e A në fundin 3′ të abetares
Kur fundi 3' i primerit nuk përputhet, ka dallime të mëdha në efikasitetin e sintezës së bazave të ndryshme.Kur baza e fundit është A, ajo gjithashtu mund të inicojë sintezën e zinxhirit edhe në rastin e mospërputhjes, dhe kur baza e fundit është T Kur , efikasiteti i induksionit të mospërputhjes zvogëlohet shumë.Prandaj, përpiquni të shmangni zgjedhjen e A në fundin 3′ të abetares dhe është më mirë të zgjidhni T.
Nëse është një primer sondë, fundi 5′ i sondës nuk mund të jetë G, sepse edhe kur një bazë e vetme G është e lidhur me grupin e raportuesit fluoreshent FAM, G mund të shuajë gjithashtu sinjalin fluoreshent të emetuar nga grupi FAM, duke rezultuar në rezultate të rreme negative.Shfaqet.
5. Shpërndarja e bazës
Shpërndarja e katër bazave në abetare preferohet të jetë e rastësishme, duke shmangur më shumë se 3 G ose C të njëpasnjëshme në fundin 3' dhe më shumë se 3 të njëpasnjëshme.G ose C janë të lehta për të gjeneruar çiftim në rajonin e sekuencës së pasur me GC.
6. Rajoni i projektimit të primerit duhet të shmangë strukturat komplekse dytësore.
Struktura dytësore e formuar nga vargu i vetëm i produktit të amplifikimit do të ndikojë në ecurinë e qetë të PCR.Duke parashikuar paraprakisht nëse ka një strukturë dytësore në sekuencën e synuar, përpiquni të shmangni këtë rajon në hartimin e abetareve.
7. Vetë abetaret dhe ndërmjet abetareve duhet të përpiqen të shmangin bazat e njëpasnjëshme plotësuese.
Nuk mund të ketë komplementaritet të njëpasnjëshëm me 4 baza midis vetë abetares dhe primerit.Vetë abetarja nuk duhet të ketë një sekuencë plotësuese, përndryshe do të paloset për të formuar një strukturë flokësh, e cila do të ndikojë në kombinimin e pjekjes së primerit dhe shabllonit.
Sekuencat plotësuese nuk mund të ekzistojnë midis primerëve në rrjedhën e sipërme dhe të poshtme.Komplementariteti midis primerëve do të prodhojë dimerë primer, të cilët do të reduktojnë efikasitetin e PCR dhe madje do të ndikojnë në saktësinë sasiore.Nëse strukturat primer-dimer dhe kapëse flokësh janë të pashmangshme, vlera △G nuk duhet të jetë shumë e lartë (duhet të jetë më pak se 4,5 kcal/mol).
8. Primerët amplifikojnë produktin specifik të synuar.
Qëllimi përfundimtar i zbulimit të qPCR është të kuptojë bollëkun e gjenit të synuar.Nëse ndodh përforcim jo specifik, sasia do të jetë e pasaktë.Prandaj, pasi primerët të jenë projektuar, ato duhet të testohen nga BLAST dhe specifikat e produkteve krahasohen në bazën e të dhënave të sekuencës.
Më pas, ne marrim gjenin e njeriut GAS6 (Growth arrest specific 6) si shembull për të dizajnuar primerët qPCR.
01 gjen pyetës
Homo GAS6përmes NCBI.Këtu, duhet t'i kushtojmë vëmendje krahasimit të emrit të gjenit dhe specieve për t'u siguruar që ato janë të qëndrueshme.
02 Gjeni sekuencën e gjeneve
(1) Nëse sekuenca e synuar është ADN gjenomike, zgjidhni të parën, që është sekuenca e ADN-së gjenomike e gjenit.
(2) Nëse sekuenca e synuar është mRNA, zgjidhni të dytën.Pas hyrjes, klikoni "CDS" në tabelën e mëposhtme.Sekuenca e sfondit kafe është sekuenca koduese e gjenit.
03 Abetare të projektimit
Futni ndërfaqen Primer-BLAST
Futni numrin e sekuencës së gjenit ose sekuencën në formatin Fasta sipër majtas dhe plotësoni parametrat përkatës.

Klikoni "Merr abetare" dhe NCBI do të shfaqet për t'ju thënë se një përzgjedhje e tillë e parametrave do të përforcohet me variante të tjera bashkimi.Mund të kontrollojmë variantet e ndryshme të bashkimit dhe t'i paraqesim për të marrë çiftin e duhur të primerit (siç tregohet në figurën më poshtë).Ky proces mund të marrë dhjetëra sekonda për të ekzekutuar.
Temperaturat e pjekjes së këtyre çifteve të primerit janë rreth 60°C.Sipas qëllimit të eksperimentit, zgjidhni abetare me gjatësi të moderuar, specifikë të mirë dhe më pak vetë-plotësim të abetareve për eksperimentin dhe shkalla e suksesit është mjaft e lartë!
04 Verifikimi i specifikës së abetares
Në fakt, përveç dizajnimit të primerëve, Primer-Blast mund të vlerësojë edhe primerët që kemi projektuar vetë.Kthehuni në faqen e dizajnit të primerit, futni primerët e sipërm dhe të poshtëm që kemi projektuar dhe parametrat e tjerë nuk do të rregullohen.Pas dorëzimit, mund të shihni nëse çifti i abetareve ekziston edhe në gjene të tjera.Nëse të gjitha shfaqen në gjenin që duam të amplifikojmë, duke treguar se specifika e këtij çifti abetaresh është e madhe!(Për shembull, ky është i vetmi rezultat i pyetjes së abetares!)

05 Gjykimi i cilësisë së abetares
Çfarë lloj primeri është abetarja "perfekte" që kombinon "efikasitetin e amplifikimit deri në standard", "karakteristikat e produktit të përforcuar" dhe "rezultatet e besueshme eksperimentale"?
Efikasiteti i amplifikimit

kurba e shkrirjes
Efikasiteti i amplifikimit të primerëve arrin 90%-110%, që do të thotë se efikasiteti i amplifikimit është i mirë, dhe kurba e shkrirjes ka një kulm të vetëm dhe zakonisht Tm>80°C, që do të thotë se specifika e amplifikimit është e mirë.
 
Produkte të ngjashme:
PCR Easy–SYBR GREEN I në kohë reale
PCR Easy-Taqman në kohë reale