PCR në kohë reale, e njohur edhe si PCR sasiore ose qPCR, është një metodë për monitorimin dhe analizën në kohë reale të produkteve të amplifikimit të PCR.
Për shkak se PCR sasiore ka avantazhet e funksionimit të thjeshtë, të shpejtë dhe të përshtatshëm, ndjeshmëri të lartë, përsëritshmëri të mirë dhe shkallë të ulët të ndotjes, përdoret gjerësisht në testimin mjekësor, vlerësimin e efikasitetit të ilaçeve, kërkimin e shprehjes së gjeneve, kërkimin transgjenik, zbulimin e gjeneve, zbulimin e patogjenit, zbulimin e kafshëve dhe bimëve., testimi i ushqimit dhe fusha të tjera.
Prandaj, nëse jeni të angazhuar në kërkime bazë në shkencat e jetës, ose punonjës të kompanive farmaceutike, kompanive të blegtorisë, kompanive ushqimore, apo edhe punonjës të zyrave të inspektimit dhe karantinës hyrëse-dalëse, departamenteve të monitorimit të mjedisit, spitaleve dhe njësive të tjera, do të jeni pak a shumë të ekspozuar ndaj ose duhet të dini njohuritë e zotërimit të PCR sasiore.

Parimi i PCR në kohë reale

PCR në kohë reale është një metodë në të cilën substancat fluoreshente shtohen në sistemin e reaksionit PCR, dhe intensiteti i sinjalit të fluoreshencës në procesin e reaksionit PCR monitorohet në kohë reale nga një instrument sasior PCR, dhe në fund analizohen dhe përpunohen të dhënat eksperimentale.

【Kurba e amplifikimit】është kurba që përshkruan procesin dinamik të PCR.Kurba e amplifikimit të PCR nuk është në fakt një kurbë standarde eksponenciale, por një kurbë sigmoide.

[Faza e platformës së kurbës së amplifikimit]Me rritjen e numrit të cikleve të PCR, inaktivizimin e polimerazës së ADN-së, pakësimin e dNTP-ve dhe primerëve dhe frenimin e reaksionit të sintezës nga nënprodukti i reaksionit pirofosfat, etj., PCR jo gjithmonë zgjerohet në mënyrë eksponenciale., dhe përfundimisht do të hyjë në një pllajë.

[Kurba e përforcimit të rajonit të rritjes eksponenciale]Megjithëse faza e pllajës ndryshon shumë, në një rajon të caktuar të rajonit të rritjes eksponenciale të lakores së amplifikimit, përsëritshmëria është shumë e mirë, gjë që është shumë e rëndësishme për analizën sasiore të PCR.

[Vlera e pragut dhe vlera Ct]Ne vendosëm vlerën kufi të zbulimit të fluoreshencës në pozicionin e duhur në zonën e rritjes eksponenciale të lakores së amplifikimit, përkatësisht vlerën e pragut (Threshold).Kryqëzimi i vlerës së pragut dhe kurbës së amplifikimit është vlera Ct, domethënë, vlera Ct i referohet numrit të cikleve (Cikli i Pragut) kur arrihet vlera e pragut.

Grafiku më poshtë tregon qartë marrëdhënien midis vijës së pragut dhe kurbës së amplifikimit, pragut dhe vlerës Ct.

【Si të përcaktohet sasia?】

Është vërtetuar nga teoria matematikore se vlera Ct ka një marrëdhënie lineare të anasjelltë me logaritmin e numrit të shablloneve fillestare.PCR në kohë reale monitoron produktet e amplifikimit PCR në kohë reale dhe i vlerëson ato gjatë fazës së amplifikimit eksponencial.

Për çdo cikël të PCR, ADN-ja u rrit në mënyrë eksponenciale me 2 herë, dhe shpejt arriti një pllajë.

Duke supozuar se sasia e ADN-së fillestare është A₀ , pas n cikleve, sasia teorike e produktit të ADN-së mund të shprehet si:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Pastaj, sa më shumë të jetë sasia fillestare e ADN-së A 0, aq më shpejt sasia e produktit të përforcuar arrin vlerën e zbulimit An , dhe numri i cikleve kur arrihet An është vlera Ct.Kjo do të thotë, sa më shumë të jetë sasia fillestare e ADN-së A 0, aq më herët arrin kulmin e kurbës së amplifikimit, dhe përkatësisht numri i kërkuar i cikleve n është më i vogël.

Ne kryejmë hollimin gradient të standardit të përqendrimit të njohur dhe e përdorim atë si një shabllon për PCR në kohë reale dhe një seri kurbash amplifikimi do të përftohen në intervale të barabarta në rendin e sasisë fillestare të ADN-së nga më shumë në më pak.Sipas marrëdhënies lineare ndërmjet vlerës Ct dhe logaritmit të numrit të shablloneve fillestare, një[kurba standarde] mund të krijohet.

Duke zëvendësuar vlerën Ct të kampionit me përqendrim të panjohur në kurbën standarde, mund të merret sasia fillestare e modelit të kampionit me përqendrim të panjohur, që është parimi sasior i PCR në kohë reale.

Metoda e zbulimit të PCR në kohë reale

PCR në kohë reale zbulon produktet e amplifikimit të PCR duke zbuluar intensitetin e fluoreshencës në sistemin e reagimit.

Parimi i metodës së futjes së ngjyrave fluoreshente】

Ngjyra fluoreshente, të tilla si TB Green ®, mund të lidhet në mënyrë jospecifike me ADN-në me dy zinxhirë në sistemet PCR dhe të fluoreshojë pas lidhjes.

Intensiteti i fluoreshencës në sistemin e reagimit u rrit në mënyrë eksponenciale me rritjen e cikleve të PCR.Duke zbuluar intensitetin e fluoreshencës, sasia e amplifikimit të ADN-së në sistemin e reaksionit mund të monitorohet në kohë reale dhe më pas sasia e shabllonit fillestar në mostër mund të vlerësohet në mënyrë të kundërt.

【Parimi i metodës së sondës fluoreshente】

sonda fluoreshenteështë një sekuencë e acidit nukleik me një grup fluoreshent në fundin 5' dhe një grup shuarjeje në fundin 3', i cili mund të lidhet në mënyrë specifike me shabllonin.Kur sonda është e paprekur, fluoreshenca e emetuar nga fluorofori shuhet nga grupi shuarës dhe nuk mund të fluoreshojë.Kur sonda dekompozohet, substanca fluoreshente do të shkëputet dhe do të lëshojë fluoreshencë.

Një sondë fluoreshente i shtohet tretësirës së reaksionit PCR.Gjatë procesit të pjekjes, sonda fluoreshente do të lidhet me pozicionin specifik të shabllonit.Gjatë procesit të zgjatjes, aktiviteti 5'→3' ekzonukleaza i enzimës PCR mund të dekompozojë sondën fluoreshente të hibridizuar me shabllonin dhe substanca fluoreshente shpërndahet për të emetuar fluoreshencë.Duke zbuluar intensitetin e fluoreshencës së sondës në sistemin e reaksionit, mund të arrihet qëllimi i monitorimit të sasisë së amplifikimit të produktit PCR.

【Përzgjedhja e metodës së zbulimit të fluoreshencës】

Nëse përdoret për të dalluar sekuencat me homologji të lartë dhe për të kryer zbulimin multipleks PCR si analiza e tipit SNP, metoda e sondës fluoreshente është e pazëvendësueshme.
Për eksperimente të tjera PCR në kohë reale, mund të përdoret një metodë kimere fluoreshente e thjeshtë, e lehtë dhe me kosto të ulët.

sonda Specifikimi i fortë, i aftë për PCR multipleks

Mangësi

Kërkesa të larta specifike për amplifikimin;

PCR multiplex nuk mund të kryhet Nevojë për të projektuar sonda specifike, me kosto të lartë;

ndonjëherë dizajnimi i sondës është i vështirë

Produkte të ngjashme: