RT-qPCR është eksperimenti bazë i biologjisë molekulare dhe të gjithë duhet ta njohin atë.Kryesisht përfshin tre hapa: nxjerrjen e ARN-së, transkriptimin e kundërt në cDNA dhe PCR sasiore fluoreshente në kohë reale.Nuk ndihmon, çfarë po ndodh?Ka të ngjarë që të ketë një problem meeksperimenti i transkriptimit të kundërt!Edhe pse duket se eksperimenti i transkriptimit të kundërt duhet vetëm të shtojë ARN, dNTP, primerë dhetranskriptaza e kundërtnë tubin e centrifugës dhe përzieni mirë, por në procesin aktual të funksionimit, ka ende shumë detaje që duhet t'u kushtohen vëmendje.Le të mësojmë për të!

Si të gjykoni cilësinë e ARN-së?
Për të marrë cADN, cilësia e ARN-së është kritike!Cilësia e ARN-së mund të zbulohet kryesisht nga dy aspekte:
(1) Integriteti i ARN-së:Integriteti i ARN-së mund të verifikohet me elektroforezë me xhel agarozë. Duke marrë si shembull eukariotët, ARN-ja totale e plotë ka tre breza të qartë, pesha molekulare nga e madhe në të vogël është 28S, 18S dhe 5S, dhe 28S është dy herë më e ndritshme se 18S;nëse mund të shihen tre breza, por lloji i brezit është i paqartë ose Difuzioni do të thotë se ARN është degraduar pjesërisht.Në këtë moment, kryeni menjëherë reagimin e kundërt të transkriptimit dhe rrisni hyrjen e shabllonit në mënyrë të përshtatshme;nëse mund të shihet vetëm një brez me peshë të vogël molekulare ose pa brez, ARN-ja është degraduar plotësisht dhe duhet të riekstraktohet.Agilent 2100 tregon integritetin e ARN-së me diagramin e pikut dhe vlerën RIN.Nëse acidi nukleik është i paprekur, vija bazë e elektroferogramit është e sheshtë;nëse acidi nukleik është degraduar rëndë, niveli bazë është i pabarabartë dhe shfaqen më shumë maja degradimi;vlera e RIN pasqyron integritetin e ARN-së, brenda intervalit 0-10, sa më e madhe të jetë vlera, aq më e mirë është cilësia e ARN-së.Epo, aq më e lartë është shkalla e plotësisë.
(2) Pastërtia e ARN:Raporti i OD260/280 mund të zbulohet me anë të spektrofotometrisë UV.Nëse raporti i OD260/280 është midis 1.9 dhe 2.1, pastërtia është shumë e mirë.
ADN-ja gjenomike e mbetur mund të çojë në rezultate të pasakta sasiore
Kur ARN-ja nxirret, ARN-ja që marrim mund të përzihet me ADN gjenomike (gADN) që nuk është pastruar.Prandaj, cDNA pas transkriptimit të kundërt do të përzihet gjithashtu megADN.Gjatë rrjedhës së poshtmeqPCRreagimi,cADNdhe gADN mund të përforcohet njëkohësisht, duke rezultuar në një vlerë relativisht të vogël CT, kështu që rezultatet mund të jenë të njëanshme.
Pra, çfarë duhet të bëjmë në këtë situatë?Foregenesugjeron:
(1) Kryeni pastrimin e gjenomit në ARN-në e kundërt, e cila mund të hiqet me nxjerrjen e kolonës gjatë nxjerrjes së ARN-së;
(2) Trajtoni ARN-në e nxjerrë me DNazëI , por mbylleni me EDTA;
të reagentëve të transkriptimit të kundërtme module për pastrimin e gjenomit;

Si të zgjidhni abetare për transkriptimin e kundërt?
Abetaret e transkriptimit të kundërt gjithashtu ndikojnë në rezultatin e reaksionit të transkriptimit të kundërt.Ju mund të zgjidhni primerë të rastësishëm, Oligo dT ose primerë specifikë për gjen për transkriptimin e kundërt sipas rrethanave specifike të eksperimentit:
(1) Transkriptet specifike: rekomandohen primerë specifikë për gjenet;
(2) Transkriptet e fragmenteve të gjata: Rekomandohen primerë oligo dT/gjene specifike;
(3) Fragmente të brendshme të transkripteve të segmenteve të gjata: primerë specifikë për gjen/ primerë të rastësishëm / primerë të rastësishëm + Oligo dT.Nëse kryhet eksperimenti i mëpasshëm qPCR, Oligo dT nuk mund të përdoret vetëm, sepse përdorimi vetëm i Oligo dT mund të shkaktojë paragjykim të skajit 3', duke çuar në rezultate të pasakta të eksperimentit qPCR;
(4) miRNA: Mund të përdoren primerë me unazë rrjedhëse ose primerë për bisht.

Sa herë duhet të hollohet cADN e produktit të transkriptimit të kundërt për të përcaktuar sasinë?
Pas marrjes së cDNA-së së produktit të transkriptimit të kundërt, sa herë duhet të hollohet cDNA për eksperimentet qPCR është shumë e rëndësishme.Nëse përqendrimi i cDNA është shumë i lartë ose shumë i ulët, efikasiteti i amplifikimit mund të ndikohet.A mund të matet përqendrimi i cADN-së dhe si duhet bërë?
(1) Përqendrimi i cDNA-së i produktit të transkriptimit të kundërt nuk mund të matet, sepse përveç produktit të transkriptimit të kundërt, produkti i transkriptimit të kundërt përmban gjithashtu Buferin e mbetur të transkriptimit të kundërt, transkriptazën e kundërt, primerët, etj., të cilat do të ndërhyjnë në rezultatet e matjes së përqendrimit dhe do të shkaktojnë OD260/280, si rrjedhojë OD260, jo e vërtetë dhe OD200.Në këtë kohë, disa miq do të thonë, atëherë unë do të masë përqendrimin pas pastrimit;këtu, Foregene do të donte të kujtonte se cDNA nuk rekomandohet të pastrohet, sepse gjatësia e cDNA-së e marrë nga kthimi është e ndryshme dhe cDNA e shkurtër do të humbasë gjatë pastrimit.
(2) Pra, çfarë të bëni?Përpara eksperimentit qPCR, gradienti i hollimit të cDNA mund të përcaktohet përmes eksperimentit paraprak.Për shembull: përdorni solucionin rezervë të cDNA, hollimin 10-fish dhe hollimin 100-fish si shabllone për eksperimentet qPCR dhe zgjidhni faktorin e hollimit me një vlerë CT në intervalin 18-28.

Si duhet të transkriptohen miRNA-të e kundërta?
miRNA është një ARN e vogël molekulare me një zinxhir me një madhësi prej rreth 22 nt që nuk kodon për proteina.Për shkak të gjatësisë së saj të shkurtër, metoda konvencionale qPCR është e vështirë për ta përcaktuar drejtpërdrejt sasinë e saj, kështu që shpesh është e nevojshme të zgjerohet miRNA;metodat e përdorura zakonisht të transkriptimit të kundërt për miRNA përfshijnë metodën stem-loop dhe metodën e bishtit.
Metoda stem-loop është zgjerimi i miARN-së duke shtuar abetare të ciklit të rrjedhjes.Kjo metodë zbulimi ka ndjeshmëri dhe specifikë më të lartë, por xhiroja e zbulimit është e ulët.Një transkriptim i kundërt mund të zbulojë vetëm një miRNA dhe një referencë të brendshme;metoda e shtimit të bishtit përbëhet nga dy. Ajo plotësohet nga veprimi i përbashkët i dy enzimave, të cilat janë polimeraza PolyA dhe transkriptaza e kundërt.Polimeraza PolyA është përgjegjëse për shtimin e bishtave të PolyA në miRNA për të rritur gjatësinë e saj dhe transkriptaza e kundërt kryen reaksionin e transkriptimit të kundërt.Kjo metodë ka shpejtësi të lartë zbulimi dhe mund të zbulojë miRNA të shumta dhe referenca të brendshme në një transkriptim të kundërt, por ndjeshmëria dhe specifika janë të ulëta në metodën e ciklit stem.