Të gjithë po flasin për parimin e eksperimentit qRT-PCR, dizajnin e primerit, interpretimin e rezultateve etj., por mendoj se duhet të ndaj me ju funksionimin eksperimental të qRT-PCR.Është i vogël, por ka të bëjë me rezultate.
Përpara se të bëjmë qRT-PCR, duhet të kemi një kuptim të qartë të ARN-së sonë dhe metodave të funksionimit.Në fund të fundit, përpjekjet tona synojnë të arrijmë rezultate dhe jo thjesht të praktikojmë.Pra, përpara se të bëjmë qRT-PCR, duhet të përcaktojmë çështjet e mëposhtme (disa prej të cilave janë të zbatueshme vetëm për SYBR).
1 Jeni i sigurt që ARN-ja juaj nuk është e degraduar?
NanoDrop 2000 mund të zbulojë vetëm përqendrimin dhe pastërtinë e ARN-së, por nuk mund të zbulojë integritetin e ARN-së.
Vlera e ARN-së (Numri i Intesitetit të ARN-së) mund të pasqyrojë integritetin e ARN-së, e cila zbulohet nga sistemi Agilent 2100 Bioanalyzer.
Fig. Diagrami skematik i vlerave të RIN për mostra të ndryshme ARN (eukariote)
Megjithatë, laboratorët në përgjithësi nuk kanë Agilent 2100 Bioanalyzer.Në këtë rast, ne mund të zbulojmë përmes xhelit të formaldehidit, por kërkesa për sasinë totale të ARN-së është e lartë, kështu që metoda më e shpejtë është përdorimi i elektroforezës së zakonshme të xhelit.Kërkohet të jetë në një mjedis pa nukleaza, prandaj është e nevojshme të shpëlahet rezervuari i elektroforezës, shishja e solucionit, kllapa xhel dhe krehja me ujë DEPC.Agaroza është gjithashtu pa nukleaza (për sa kohë që është e sapohapur), dhe Loading Buffer duhet të hapet sa më shumë që të jetë e mundur, me xhel 1.2%.
Vini re se xheli duhet të tretet plotësisht, përndryshe do të shkaktojë breza johomogjenë, siç tregohet në mostrën 9 në figurë.Nëse voltazhi është shumë i lartë ose funksionon për një kohë të gjatë, do të gjenerojë nxehtësi dhe do të shkaktojë degradim të ARN-së, kështu që tensioni dhe koha duhet të kontrollohen në mënyrë të arsyeshme.Përveç kësaj, funksionimi i xhelit gjithashtu mund të përcaktojë më tej nëse ka mbetje ADN në kampion dhe të vëzhgojë nëse ka një numër të madh brezash të mbajtur në pusin shpërndarës.
Figura.Zbulimi i ARN me elektroforezë me xhel
2 A jeni i sigurt për përqendrimin e cADN-së tuaj?
Përvoja e vëllezërve të mëdhenj në laborator është se cDNA e sistemit 20 ul e marrë nga çdo përmbysje hollohet drejtpërdrejt 20X, ndërsa motrat pas doktoraturës hollohen 10X.Zakonisht varem nga situata.Për shkak se cilësia e ARN-së e përmendur nga çdo person është e ndryshme, niveli i kthimit është gjithashtu i ndryshëm dhe teknologjia e kthimit mund të mos jetë e qëndrueshme.
Pra, sa herë që marr cDNA-në e kundërt, fillimisht do ta holloj rreth 3 herë, dhe më pas do të përdor gjenin e shtëpisë për të bërë RT-PCR, numri i cikleve është përgjithësisht 25 cikle, për të identifikuar përqendrimin specifik dhe më pas do të përcaktoj faktorin përfundimtar të hollimit.
3 Jeni i sigurt se abetaret tuaja janë të lehta për t'u përdorur?
Mund të kalojë kurbën e shkrirjes së qRT-PCR, por kjo gjithsesi kushton para.Për laboratorët pa shumë para, kur marrin shumë primerë, mund të përdorin RT-PCR të zakonshme për të parë nëse është një brez i vetëm dhe për të identifikuar specifikën e primerëve.Nëse laboratorit nuk i mungojnë paratë, specifika e të gjithë abetareve mund të identifikohet një herë përmes kurbës së shkrirjes.
4 Jeni i sigurt se kushtet tuaja eksperimentale janë të përshtatshme?
SYBR duhet të mbrohet nga drita e fortë, kështu që përpiquni të fikni dritën e sipërme kur shtoni reagent SYBR dhe duhet të përdorni vetëm dritë të zbehtë për ta përfunduar atë.
Ruani SYBR në 4°C.Kur është në përdorim, përmbyseni butësisht lart e poshtë për t'u përzier mirë për të shmangur shkumën dhe mos vorbulloni fuqishëm.
Disa motra më të vogla pëlqejnë të vizatojnë shenja në tabelën PCR nga frika e përzierjes së mostrave, gjë që është e gabuar.Për shkak se shënuesit tuaj kanë shumë të ngjarë të ndikojnë në grumbullimin e sinjaleve fluoreshente, në përgjithësi u rekomandoj të rinjve të përdorin fletore eksperimentale për të ndihmuar në kujtesë, siç tregohet më poshtë.
Figura.Diagrami i ngarkimit të mostrës qRT-PCR
5 Jeni i sigurt që po e bëni siç duhet?
Sigurohuni që të vishni doreza, të vishni doreza, të vishni doreza dhe të thoni gjëra të rëndësishme tri herë.
Për të reduktuar ekspozimin e SYBR ndaj dritës, personalisht më pëlqen të shtoj një shabllon fillimisht, siç tregohet në figurën më poshtë.Sipas përvojës, shtimi i një sasie të vogël shablloni ka të ngjarë të shkaktojë gabime në marrjen e mostrave.Prandaj, për të minimizuar gabimin e shkaktuar nga shtimi i një sasie të vogël shablloni, zakonisht dyfishoj përsëri kampionin dhe dyfishoj sasinë kur shtoj kampionin për të zvogëluar sasinë e H2O2 të shtuar.
Figura.Diagrami skematik i ngarkimit qRT-PCR
Pastaj konfiguroni sistemin qRT-PCR si më poshtë.
Figura.Diagrami i përgatitjes së sistemit qRT-PCR
SHËNIM: Procesi i konfigurimit duhet të kryhet në akull.
Pas shtimit të mostrës, ngjitni filmin e vulosjes transparente.Mundohuni të mos prekni me duar sipërfaqen e filmit izolues transparent, thjesht veproni nga hapësira në të dy anët e filmit.Sepse gjurmët e gishtërinjve mund të ndikojnë gjithashtu në mbledhjen e sinjaleve fluoreshente.Më pas përdorni një centrifugë për të centrifuguar shpejt për 10 s me shpejtësi të ulët për të parandaluar që kampioni të varet në mur.
Produkte të ngjashme:
Koha e postimit: Prill-28-2023
