Kompleti qPCR i RT-së së drejtpërdrejtë me qelizë—Sonda e kompleteve qRT-PCR me një hap të gatshëm të qelizës Taqman Direct
Përshkrimet
Ky produkt përdor një sistem unik tampon lize për të çliruar shpejt ARN nga mostrat e qelizave të kultivuara për reaksionet RT-qPCR, duke eliminuar procesin e pastrimit të ARN-së që kërkon kohë dhe të mundimshme, dhe vetëm 7 minuta për të marrë shabllonin e kërkuar të ARN-së, me 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman rezultate të shpejta dhe efikase të siguruara nga kit-Taqman në kohë reale.
5× Direct RT Mix dhe 2× Direct qPCR Mix-Taqman kanë tolerancë të fortë ndaj frenuesit dhe mund të kryejnë kthim efikas dhe përforcim specifik duke përdorur lizën e kampionit që do të matet si shabllon.Reagenti përmban Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq ADN Polimerase, dNTPs, MgCl2, Reaction Buffer, PCR Optimizer dhe Stabilizer, i cili mund të përdoret me tampon lysis për të zbuluar shpejt dhe me lehtësi mostrat, dhe ka karakteristikat e ndjeshmërisë, specifikës dhe stabilitetit të lartë.
Specifikimet
200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns
Komponentët e kompletit
| QuickEasyTMCell Direct RT-qPCR Kit-Taqman | ||||
| Komponentët e kompletit 20μl qPCR Reaction System | DRT-01021 | DRT-01022 | shënim | |
| 200 T | 1000 T | |||
|
Pjesë I | Tampon CL | 4 ml | 20 ml | Liza e qelizave |
| Foregene Proteaza Plus II | 80 μl | 400 μl | ||
| Tampon ST | 400 μl | 1 ml × 2 | ||
|
Pjesë II | Gomë ADN-je | 80 μl | 400 μl | |
| 5×Përzierje e drejtpërdrejtë RT * | 160 μl | 800 μl | RT | |
| 2× Direct qPCR Mix-Taqman * | 1 ml × 2 | 1,7 ml × 6 | qPCR | |
| Bojë referimi 20×ROX | 40 μl | 200 μl | ||
| DdH pa RNase2O | 1.7 ml | 10 ml | ||
| Manuali i Udhëzimeve | 1 copë | 1 copë | ||
*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman mund të blihen veçmas
Karakteristikat dhe avantazhet
■E thjeshtë dhe efektive: me teknologjinë Cell Direct RT, mostrat e ARN-së mund të merren në vetëm 7 minuta.
■ Kërkesa e mostrës është e vogël, deri në 10 qeliza mund të testohen.
■ Rezultat i lartë: mund të zbulojë shpejt ARN në qelizat e kultivuara në pllaka 384, 96, 24, 12, 6 pusesh.
■ Goma e ADN-së mund të heqë shpejt gjenomet e lëshuara, duke reduktuar shumë ndikimin në rezultatet e mëvonshme eksperimentale.
■ Sistemi i optimizuar RT dhe qPCR e bën transkriptimin e kundërt RT-PCR me dy hapa më efikas dhe PCR më specifik dhe më rezistent ndaj frenuesve të reaksionit RT-qPCR.
Aplikimi i kompletit
Fusha e aplikimit: qeliza të kultivuara.
- ARN e çliruar nga liza e mostrës: e zbatueshme vetëm për shabllonin RT-qPCR të këtij kompleti.
- Kompleti mund të përdoret për qëllimet e mëposhtme: analiza e shprehjes së gjeneve, verifikimi i efektit të heshtjes së gjeneve të ndërmjetësuara nga siRNA, shqyrtimi i barnave, etj.
Ruajtja dhe afati i ruajtjes
Pjesa I e këtij kompleti duhet të ruhet në 4℃;Pjesa II duhet të ruhet në -20℃.
Foregene Protease Plus II duhet të ruhet në 4℃, mos ngrini në -20℃.
Reagenti 2×Direct qPCR Mix-Taqman duhet të ruhet në -20℃në padituri;nëse përdoret shpesh, mund të ruhet edhe në 4℃ për ruajtje afatshkurtër (përdoret brenda 10 ditëve).
Parimet e projektimit të primerit PCR në kohë reale
Forward Primer dhe Reverse Primer
Për PCR në kohë reale, dizajni i primerit është shumë i rëndësishëm.Primerët lidhen me specifikën dhe efikasitetin e amplifikimit PCR dhe mund të dizajnohen duke iu referuar parimeve të mëposhtme:
- Gjatësia e primerit: 18-30 bp.
- Përmbajtja GC: 40-60%.
- Vlera Tm: Softueri i projektimit të Primer, siç është Primer 5, mund të japë vlerën Tm të primerit.Vlerat e Tm të primerëve në rrjedhën e sipërme dhe të poshtme duhet të jenë sa më afër që të jetë e mundur.Formula e llogaritjes së Tm mund të përdoret gjithashtu: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Gjatë kryerjes së PCR, një temperaturë nën vlerën Tm të primerit prej 5 °C zgjidhet përgjithësisht si temperatura e pjekjes (rritja përkatëse në temperaturën e pjekjes mund të rrisë specifikën e reaksionit PCR).
- Primerë dhe produkte PCR:
- Gjatësia e produktit për amplifikimin e PCR të primerit të projektimit preferohet të jetë 100-150 bp.
- Abetaret e projektimit në zonën strukturore dytësore të shabllonit duhet të shmangen sa më shumë që të jetë e mundur.
- Shmangni formimin e 2 ose më shumë bazave plotësuese midis skajeve 3' të primerëve në rrjedhën e sipërme dhe të poshtme.
- Baza terminale e primerit 3' nuk mund të jetë e pranishme me 3 G ose C shtesë të njëpasnjëshme.
- Vetë primerët nuk mund të kenë struktura plotësuese, përndryshe do të krijohet një strukturë fije flokësh, e cila ndikon në amplifikimin e PCR.
- ATCG duhet të shpërndahet sa më në mënyrë të barabartë të jetë e mundur në sekuencën e primerit dhe baza e terminalit 3′ duhet të shmanget si T.
Shtojca1: Cell DirectRT-qPCR Komponenti i kompletitt paketë shtesë
1.Tretësira e lizës së qelizave
| Zgjidhja e lizës së qelizave | |||
| Komponentët e kompletit (Sistemi i lizës 24 pusi / pus) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 T | 500 T | ||
| PjesëI | Tampon CL | 20 ml | 100 ml |
| Foregene Proteaza Plus II | 400 μl | 1 ml × 2 | |
| Tampon ST | 1 ml × 2 | 10 ml | |
| PjesëII | Gomë ADN-je | 400 μl | 1 ml × 2 |
| Përzierje RT | |
| Komponentët e kompletit (Sistemi i reagimit 20 μl) | DRT-01011-B1 |
| 200 T | |
| 5× Përzierje e drejtpërdrejtë RT | 800 μl |
| DdH pa RNase2O | 1,7 ml × 2 |
| Përzierje qPCR | ||
| Komponentët e kompletit (Sistemi i reagimit 20 μl) | DRT-01021-C1 | DRT-01021-C2 |
| 200 T | 1000 T | |
| 2× Direct qPCR Mix-Taqman | 1 ml × 2 | 1,7 ml × 6 |
| 20× Bojë referimi ROX | 40 μl | 200 μl |
| DdH pa RNase2O | 1.7 ml | 10 ml |
Manualet e udhëzimeve:
