Kompleti qRT-PCR i RT-së së drejtpërdrejtë në qelizë—SYBR GREEN I Lizë e drejtpërdrejtë qelizore Komplete qRT-PCR me një hap të gatshëm
Përshkrimet
Ky komplet përdor një sistem unik tampon lize që mund të çlirojë shpejt ARN nga mostrat e qelizave të kultivuara për reaksionet RT-qPCR, duke eliminuar kështu procesin e pastrimit të ARN-së që kërkon kohë dhe të mundimshme.Modeli i ARN-së mund të merret në vetëm 7 minuta.5×Përzierje e drejtpërdrejtë RT dhe 2×Reagentët e drejtpërdrejtë qPCR Mix-SYBR të ofruara nga kompleti mund të marrin shpejt dhe në mënyrë efektive rezultate sasiore PCR në kohë reale.
5×Përzierje e drejtpërdrejtë RT dhe 2×Direct qPCR Mix-SYBR kanë tolerancë të fortë ndaj frenuesit dhe lizati i mostrave mund të përdoret si shabllon për RT-qPCR drejtpërdrejt.Ky komplet përmban transkriptazën e kundërt Foregene me afinitet të lartë të ARN-së dhe polimerazën e ADN-së Hot D-Taq, dNTPs, MgCl2, tampon reaksioni, optimizues PCR dhe stabilizues.
Specifikimet
200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns
Komponentët e kompletit
| Pjesa I | Tampon CL |
| Foregene Proteaza Plus II | |
| Tampon ST | |
| Pjesa II | Gomë ADN-je |
| 5× Përzierje e drejtpërdrejtë RT | |
| 2× Direct qPCR Mix-SYBR | |
| Bojë referimi 50× ROX | |
| ddH2O pa RNase | |
| Udhëzimet | |
Karakteristikat dhe avantazhet
■E thjeshtë dhe efektive: me teknologjinë Cell Direct RT, mostrat e ARN-së mund të merren në vetëm 7 minuta.
■ Kërkesa e mostrës është e vogël, deri në 10 qeliza mund të testohen.
■ Rezultat i lartë: mund të zbulojë shpejt ARN në qelizat e kultivuara në pllaka 384, 96, 24, 12, 6 pusesh.
■ Goma e ADN-së mund të heqë shpejt gjenomet e lëshuara, duke reduktuar shumë ndikimin në rezultatet e mëvonshme eksperimentale.
■ Sistemi i optimizuar RT dhe qPCR e bën transkriptimin e kundërt RT-PCR me dy hapa më efikas dhe PCR më specifik dhe më rezistent ndaj frenuesve të reaksionit RT-qPCR.
Aplikimi i kompletit
Fusha e aplikimit: qeliza të kultivuara.
- ARN e çliruar nga liza e mostrës: e zbatueshme vetëm për shabllonin RT-qPCR të këtij kompleti.
- Kompleti mund të përdoret për qëllimet e mëposhtme: analiza e shprehjes së gjeneve, verifikimi i efektit të heshtjes së gjeneve të ndërmjetësuara nga siRNA, shqyrtimi i barnave, etj.
Diagramë
Ruajtja dhe afati i ruajtjes
Pjesa I e këtij kompleti duhet të ruhet në 4℃;Pjesa II duhet të ruhet në -20℃.
Foregene Protease Plus II duhet të ruhet në 4℃, mos ngrini në -20℃.
Reagenti 2×Direct qPCR Mix-SYBR duhet të ruhet në -20℃në padituri;nëse përdoret shpesh, mund të ruhet edhe në 4℃ për ruajtje afatshkurtër (përdoret brenda 10 ditëve).
Parimet e projektimit të primerit PCR në kohë reale
Forward Primer dhe Reverse Primer
Për PCR në kohë reale, dizajni i primerit është shumë i rëndësishëm.Primerët lidhen me specifikën dhe efikasitetin e amplifikimit PCR dhe mund të dizajnohen duke iu referuar parimeve të mëposhtme:
Gjatësia e primerit: 18-30 bp.
Përmbajtja GC: 40-60%.
Vlera Tm: Softueri i projektimit të Primer, siç është Primer 5, mund të japë vlerën Tm të primerit.Vlerat e Tm të primerëve në rrjedhën e sipërme dhe të poshtme duhet të jenë sa më afër që të jetë e mundur.Formula e llogaritjes së Tm mund të përdoret gjithashtu: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Gjatë kryerjes së PCR, një temperaturë nën vlerën Tm të primerit prej 5 °C zgjidhet përgjithësisht si temperatura e pjekjes (rritja përkatëse në temperaturën e pjekjes mund të rrisë specifikën e reaksionit PCR).
Primerë dhe produkte PCR:
Gjatësia e produktit për amplifikimin e PCR të primerit të projektimit preferohet të jetë 100-150 bp.
Abetaret e projektimit në zonën strukturore dytësore të shabllonit duhet të shmangen sa më shumë që të jetë e mundur.
Shmangni formimin e 2 ose më shumë bazave plotësuese midis skajeve 3' të primerëve në rrjedhën e sipërme dhe të poshtme.
Baza terminale e primerit 3' nuk mund të jetë e pranishme me 3 G ose C shtesë të njëpasnjëshme.
Vetë primerët nuk mund të kenë struktura plotësuese, përndryshe do të krijohet një strukturë fije flokësh, e cila ndikon në amplifikimin e PCR.
ATCG duhet të shpërndahet sa më në mënyrë të barabartë të jetë e mundur në sekuencën e primerit dhe baza e terminalit 3′ duhet të shmanget si T.
Shtojca 1:Paketë e komponentëve të komponentëve të kompletit Cell Direct RT-qPCR
1.Zgjidhja e lizës së qelizave
|
| |||
| Komponentët e kompletit (Sistemi i lizës 24 pusi / pus) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 T | 500 T | ||
| PjesëI | Tampon CL | 20 ml | 100 ml |
| Foregene Proteaza Plus II | 400 μl | 1 ml × 2 | |
| Tampon ST | 1 ml × 2 | 10 ml | |
| PjesëII | Gomë ADN-je | 400 μl | 1 ml × 2 |
2. Përzierje RT
|
| |
| Komponentët e kompletit (Sistemi i reagimit 20 μl) | DRT-01011-B1 |
| 200 T | |
| 5× Përzierje e drejtpërdrejtë RT | 800 μl |
| DdH pa RNase2O | 1,7 ml × 2 |
|
| ||
| Komponentët e kompletit (Sistemi i reagimit 20 μl) | DRT-01011-C1 | DRT-01011-C2 |
| 200 T | 1000 T | |
| 2× Direct qPCR Mix-SYBR | 1 ml × 2 | 1,7 ml × 6 |
| Bojë referimi 50× ROX | 40 μl | 200 μl |
| DdH pa RNase2O | 1.7 ml | 10 ml |
Manualet e udhëzimeve:
