RT-qPCR është zhvilluar nga teknologjia e zakonshme PCR.Ai shton kimikate fluoreshente (ngjyra fluoreshente ose sonda fluoreshente) në sistemin tradicional të reaksionit PCR dhe zbulon procesin e pjekjes dhe zgjatjes PCR në kohë reale sipas mekanizmave të tyre të ndryshëm ndriçues.Ndryshimet e sinjalit fluoreshent në medium përdoren për të llogaritur sasinë e ndryshimit të produktit në çdo cikël të PCR.Aktualisht, metodat më të zakonshme janë metoda e ngjyrosjes fluoreshente dhe metoda e sondës.

Metoda e ngjyrosjes fluoreshente:
Disa ngjyra fluoreshente, të tilla si SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, etj., nuk lëshojnë dritë vetë, por lëshojnë fluoreshencë pas lidhjes me brazdë të vogël të dsDNA.Prandaj, në fillim të reaksionit PCR, makina nuk mund të zbulojë sinjalin fluoreshent.Kur reaksioni vazhdon në fazën e pjekjes-zgjatjes (metoda me dy hapa) ose në fazën e zgjatjes (metoda me tre hapa), fillesat e dyfishta hapen në këtë kohë dhe polimeraza e re e ADN-së Gjatë sintezës së vargut, molekulat fluoreshente kombinohen në brazdë të vogël dsDNA dhe lëshojnë fluoreshencë.Ndërsa numri i cikleve PCR rritet, gjithnjë e më shumë ngjyra kombinohen me dsDNA dhe sinjali fluoreshent gjithashtu përmirësohet vazhdimisht.Merrni si shembull SYBR Green Ⅰ.
Metoda e sondës:
Sonda Taqman është sonda më e përdorur e hidrolizës.Ekziston një grup fluoreshent në fundin 5′ të sondës, zakonisht FAM.Sonda në vetvete është një sekuencë plotësuese e gjenit të synuar.Ekziston një grup shuarjeje fluoreshente në fundin 3' të fluoroforit.Sipas parimit të transferimit të energjisë së rezonancës fluoreshente (transferimi i energjisë i rezonancës Förster, FRET), kur grupi fluoreshente raportues (molekula fluoreshente dhuruese) dhe grupi fluoreshente shuarës (molekula fluoreshente pranuese) Kur spektri i ngacmimit mbivendoset dhe distanca e ngacmimit mbivendoset (7-10). fluoreshenca e molekulës pranuese, ndërsa autofluoreshenca dobësohet.Prandaj, në fillim të reaksionit PCR, kur sonda është e lirë dhe e paprekur në sistem, grupi fluoreshent raportues nuk do të lëshojë fluoreshencë.Gjatë pjekjes, primeri dhe sonda lidhen me shabllonin.Gjatë fazës së shtrirjes, polimeraza sintetizon vazhdimisht zinxhirë të rinj.ADN polimeraza ka aktivitet ekzonukleazë 5'-3'.Kur të arrijë në sondë, polimeraza e ADN-së do të hidrolizojë sondën nga shablloni, do të ndajë grupin fluoreshent raportues nga grupi fluoreshent shues dhe do të lëshojë sinjalin fluoreshent.Meqenëse ekziston një marrëdhënie një-për-një midis sondës dhe shabllonit, metoda e sondës është më e lartë se metoda e ngjyrosjes për sa i përket saktësisë dhe ndjeshmërisë së provës.

Fig 1 Parimi i qRT-PCR

Dizajni i primerit
Parimet:

Primerët duhet të projektohen në rajonin e konservuar të serisë së acideve nukleike dhe të kenë specifikë.

Është më mirë të përdoret sekuenca cDNA, dhe sekuenca e mRNA është gjithashtu e pranueshme.Nëse jo, zbuloni dizajnin e rajonit të CD-ve të sekuencës së ADN-së.
Gjatësia e produktit sasior fluoreshent është 80-150 bp, më e gjata është 300 bp, gjatësia e primerit është përgjithësisht midis 17-25 bazave dhe diferenca midis primerëve në rrjedhën e sipërme dhe të poshtme nuk duhet të jetë shumë e madhe.

Përmbajtja G+C është midis 40% dhe 60%, dhe 45-55% është më e mira.
Vlera e TM është midis 58-62 gradë.
Përpiquni të shmangni dimerët dhe vetëdimerët e primerit, (mos shfaqen më shumë se 4 çifte bazash të njëpasnjëshme plotësuese) strukturën e karficave të flokëve, nëse është e pashmangshme, bëni ΔG<4,5kJ/mol* Nëse nuk mund të siguroheni që gDNA të jetë hequr gjatë transkriptimit të kundërt Pastroni, është më mirë të dizajnoni abetaret *3't' të modifikuara, t'i mund të shmangen dhe të mos pasurohen. /C, struktura e vazhdueshme A/G (2-3) abetare dhe jo
specifike Homologjia e sekuencës së përforcuar heterogjenisht preferohet më pak se 70% ose ka 8 homologji bazë plotësuese.
Baza e të dhënave:
Kërko CottonFGD me fjalë kyçe
Dizajni i abetares:
Dizajni i primerit IDT-qPCR

Fig2 Faqja e veglave të projektimit të primerit në internet IDT

Fig3 Shfaqja e faqes së rezultateve
Dizajni i abetareve të lncARN:
lncARN:të njëjtat hapa si mARN.
miRNA:Parimi i metodës stem-loop: Meqenëse të gjitha miRNA-të janë sekuenca të shkurtra prej rreth 23 nt, zbulimi i drejtpërdrejtë i PCR nuk mund të kryhet, kështu që përdoret mjeti i sekuencës stem-loop.Sekuenca e ciklit të rrjedhjes është një ADN me një fije floku prej rreth 50 nt, e cila mund të formojë një strukturë flokësh në vetvete.3 'Fundi mund të projektohet si një sekuencë plotësuese e fragmentit të pjesshëm të miARN-së, më pas miARN-ja e synuar mund të lidhet me sekuencën e unazës rrjedhëse gjatë transkriptimit të kundërt dhe gjatësia totale mund të arrijë 70 bp, që është në përputhje me gjatësinë e produktit të përforcuar të përcaktuar nga qPCR.Dizajni i primerit të bishtit të miRNA.
Zbulimi specifik për amplifikimin:
Baza e të dhënave të shpërthimit në internet: Shpërthimi i CottonFGD sipas ngjashmërisë së sekuencës
Shpërthimi lokal: Referojuni përdorimit të Blast+ për të bërë shpërthim lokal, linux dhe macos mund të krijojnë drejtpërdrejt një bazë të dhënash lokale, sistemi win10 gjithashtu mund të bëhet pas instalimit të ubuntu bash.Krijoni bazën e të dhënave lokale të shpërthimit dhe shpërthimit lokal;hap ubuntu bash në win10.
Vërejtje: Pambuku në mal dhe pambuku i ishullit të detit janë kultura tetraploide, kështu që rezultati i shpërthimit shpesh do të jetë dy ose më shumë ndeshje.Në të kaluarën, përdorimi i CD-ve NAU si një bazë të dhënash për të kryer shpërthimin ka të ngjarë të gjejë dy gjene homologë me vetëm disa ndryshime SNP.Zakonisht, dy gjenet homologe nuk mund të ndahen me modelin e primerit, kështu që ato trajtohen si të njëjta.Nëse ka një indel të dukshëm, primeri zakonisht projektohet në indel, por kjo mund të çojë në strukturën dytësore të primerit. Energjia e lirë bëhet më e lartë, duke çuar në një ulje të efikasitetit të amplifikimit, por kjo është e pashmangshme.

Zbulimi i strukturës dytësore të primerit:
Hapat:hap oligo 7 → sekuencën e shabllonit të hyrjes → mbyll nëndritaren → ruaj → lokalizon abetaren në shabllon, shtyp ctrl+D për të vendosur gjatësinë e primerit → analizon struktura të ndryshme dytësore, si trupi vetëdimerizues, heterodimeri, shiriti i flokëve, mospërputhja, etj. Dy fotografitë e fundit në Figurën 4 janë rezultatet e testit të abetareve.Rezultati i abetares së përparme është i mirë, nuk ka strukturë të dukshme dimer dhe kapëse flokësh, nuk ka baza të vazhdueshme plotësuese dhe vlera absolute e energjisë së lirë është më e vogël se 4.5, ndërsa primeri i pasmë tregon vazhdimësi. 6 bazat janë plotësuese dhe energjia e lirë është 8.8;përveç kësaj, një dimer më serioz shfaqet në fundin 3′ dhe një dimer me 4 baza të njëpasnjëshme.Megjithëse energjia e lirë nuk është e lartë, dimeri 3' Chl mund të ndikojë seriozisht në specifikën e amplifikimit dhe efikasitetin e amplifikimit.Përveç kësaj, është e nevojshme të kontrolloni për shiritat e flokëve, heterodimerët dhe mospërputhjet.

Fig3 Rezultatet e zbulimit të oligo7
Zbulimi i efikasitetit të përforcimit:
Efikasiteti i amplifikimit të reaksionit PCR ndikon seriozisht në rezultatet e PCR.Gjithashtu në qRT-PCR, efikasiteti i amplifikimit është veçanërisht i rëndësishëm për rezultatet sasiore.Hiqni substancat, makineritë dhe protokollet e tjera në tampon reaksioni.Cilësia e primerëve gjithashtu ka një ndikim të madh në efikasitetin e amplifikimit të qRT-PCR.Për të siguruar saktësinë e rezultateve, si sasia e fluoreshencës relative ashtu edhe ajo absolute e fluoreshencës duhet të zbulojnë efikasitetin e amplifikimit të primerëve.Është e njohur se efikasiteti efektiv i amplifikimit qRT-PCR është midis 85% dhe 115%.Ka dy metoda:
1. Metoda standarde e kurbës:
a.Përzieni cADN-në
b.Hollimi i gradientit
c.qPCR
d.Ekuacioni i regresionit linear për llogaritjen e efikasitetit të amplifikimit
2. LinRegPCR
LinRegPCR është një program për analizën e të dhënave RT-PCR në kohë reale, të quajtura edhe të dhëna sasiore PCR (qPCR) bazuar në SYBR Green ose kimi të ngjashme.Programi përdor të dhëna të korrigjuara jo bazë, kryen një korrigjim bazë në secilën kampion veç e veç, përcakton një dritare lineariteti dhe më pas përdor analizën e regresionit linear për të përshtatur një vijë të drejtë përmes grupit të të dhënave PCR.Nga pjerrësia e kësaj linje llogaritet efikasiteti PCR i çdo kampioni individual.Efikasiteti mesatar i PCR për amplikon dhe vlera Ct për kampion përdoren për të llogaritur një përqendrim fillestar për mostër, të shprehur në njësi arbitrare fluoreshence.Hyrja dhe dalja e të dhënave bëhen përmes një spreadsheet Excel.Vetëm mostër
kërkohet përzierje, pa gradient
kërkohen hapa:(Merrni Bole CFX96 si shembull, jo plotësisht Makinë me ABI të qartë)
eksperiment:është një eksperiment standard qPCR.
Dalja e të dhënave qPCR:LinRegPCR mund të njohë dy forma të skedarëve dalës: RDML ose rezultatin e amplifikimit të kuantifikimit.Në fakt, është vlera e zbulimit në kohë reale të numrit të ciklit dhe sinjalit të fluoreshencës nga makina, dhe amplifikimi merret duke analizuar vlerën e ndryshimit të fluoreshencës të efikasitetit të segmentit linear.
Zgjedhja e të dhënave: Në teori, vlera RDML duhet të jetë e përdorshme.Vlerësohet se problemi i kompjuterit tim është se softueri nuk mund të njohë RDML, kështu që unë kam vlerën e daljes excel si të dhëna origjinale.Rekomandohet që fillimisht të kryhet një kontroll i përafërt i të dhënave, si p.sh. dështimi i shtimit të mostrave, etj. Pikat mund të fshihen në të dhënat e daljes (natyrisht, nuk mund t'i fshini, LinRegPCR do t'i injorojë këto pika në fazën e mëvonshme)

Fig5 Eksportimi i të dhënave qPCR

Fig6 përzgjedhja e mostrave kandidate

Futja e të dhënave:Hap rezultatet e amplifikimit të kualifikimit.xls, → hap LinRegPCR → skedar → lexo nga excel → zgjidhni parametrat siç tregohet në figurën 7 → OK → klikoni përcaktoni vijat bazë

Fig7 hapat e futjes së të dhënave të linRegPCR

Rezultati:Nëse nuk ka përsëritje, nuk kërkohet grupim.Nëse ka përsëritje, grupimi mund të modifikohet në grupimin e mostrës dhe emri i gjenit futet në identifikues dhe më pas i njëjti gjen do të grupohet automatikisht.Në fund, klikoni në skedar, eksportoni Excel dhe shikoni rezultatet.Efikasiteti i amplifikimit dhe rezultatet R2 të çdo pusi do të shfaqen.Së dyti, nëse ndaheni në grupe, do të shfaqet efikasiteti mesatar i korrigjuar i amplifikimit.Sigurohuni që efikasiteti i amplifikimit të secilit primer të jetë midis 85% dhe 115%.Nëse është shumë i madh ose shumë i vogël, do të thotë që efikasiteti i amplifikimit të primerit është i dobët.

Fig 8 Rezultati dhe prodhimi i të dhënave

Procesi eksperimental:
Kërkesat për cilësinë e ARN-së:
Pastërtia:1.72.0 tregon se mund të ketë izotiocianat të mbetur.Acidi nukleik i pastër A260/A230 duhet të jetë rreth 2 . Nëse ka një përthithje të fortë në 230 nm, kjo tregon se ka komponime organike si jonet fenate.Përveç kësaj, mund të zbulohet me elektroforezë me xhel agarozë 1.5%.Trego shënuesin, sepse ssARN nuk ka denatyrim dhe logaritmi i peshës molekulare nuk ka një lidhje lineare dhe pesha molekulare nuk mund të shprehet saktë.Përqendrimi: Teorikishtjomë pak se 100ng/ul, nëse përqendrimi është shumë i ulët, pastërtia është përgjithësisht e ulët jo e lartë

Fig9 Xhel ARN

Përveç kësaj, nëse kampioni është i çmuar dhe përqendrimi i ARN-së është i lartë, rekomandohet që të ndahet në një masë pas nxjerrjes dhe të hollohet ARN në një përqendrim përfundimtar prej 100-300ng/ul për transkriptim të kundërt.Nëprocesi i transkriptimit të kundërt, kur mARN transkriptohet, primerët oligo (dt) që mund të lidhen në mënyrë specifike me bishtat e polyA përdoren për transkriptimin e kundërt, ndërsa lncARN dhe circARN përdorin abetare heksamer të rastësishëm (6 mer të rastësishëm) për transkriptimin e kundërt të ARN-së totale Për miRNA, miRNA-primerët specifikë të miARN-së përdoren për reskriptimin e qafës-loopverse.Shumë kompani tani kanë lançuar komplete speciale për paketim.Për metodën stem-loop, metoda e bishtit është më e përshtatshme, me performancë të lartë dhe më kursimtare, por efekti i dallimit të miARN-ve të së njëjtës familje nuk duhet të jetë aq i mirë sa metoda stem-loop.Çdo komplet i transkriptimit të kundërt ka kërkesa për përqendrimin e primerëve specifikë për gjenet (rrathë-rrathë).Referenca e brendshme e përdorur për miRNA është U6.Në procesin e përmbysjes së unazës së kërcellit, një tub U6 duhet të përmbyset veçmas, dhe abetaret e përparme dhe të pasme të U6 duhet të shtohen drejtpërdrejt.Si circRNA ashtu edhe lncRNA mund të përdorin HKG si referencë të brendshme.NëZbulimi i cADN-së,
nëse nuk ka problem me ARN, cDNA gjithashtu duhet të jetë në rregull.Megjithatë, nëse ndiqet përsosja e eksperimentit, është më mirë të përdoret një gjen referimi i brendshëm (gjeni referues, RG) që mund të dallojë gADN-në nga cds.Në përgjithësi, RG është një gjen i mirëmbajtjes së shtëpisë., HKG) siç tregohet në Figurën 10;Në atë kohë, unë po bëja proteinën e ruajtjes së sojës dhe përdora aktin7 që përmbante introne si referencë të brendshme.Madhësia e fragmentit të përforcuar të këtij primeri në gADN ishte 452 bp, dhe nëse cDNA përdorej si shabllon, ishte 142 bp.Pastaj rezultatet e testit zbuluan se një pjesë e cDNA-së ishte në të vërtetë e kontaminuar nga gDNA, dhe gjithashtu vërtetoi se nuk kishte asnjë problem me rezultatin e transkriptimit të kundërt dhe mund të përdorej si një shabllon për PCR.Është e kotë të kryhet elektroforeza e xhelit të agarozës drejtpërdrejt me cDNA, dhe është një brez difuz, që nuk është bindës.

Fig 10 Zbulimi i cADN-së

Përcaktimi i kushteve të qPCRnë përgjithësi nuk është problem sipas protokollit të kompletit, kryesisht në hapin e vlerës tm.Nëse disa primerë nuk janë projektuar mirë gjatë projektimit të primerit, duke rezultuar në një diferencë të madhe midis vlerës tm dhe 60°C teorike, rekomandohet që cDNA Pasi të jenë përzier mostrat, të kryeni një PCR gradient me primerë dhe të përpiqeni të shmangni vendosjen e temperaturës pa breza si vlerë TM.

Analiza e të dhënave

Metoda konvencionale e përpunimit sasior PCR me fluoreshencë relative është në thelb sipas 2-ΔΔCT.Modeli i përpunimit të të dhënave.

Produkte të ngjashme:

PCR në kohë reale e lehtë^TM -Takman

PCR në kohë reale e lehtë^TM – SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix për sintezën e cDNA të vargut të parë)

RT Easy II (Master Premix për sintezën e cDNA të vargut të parë për qPCR)