PCR sasiore e fluoreshencës (e njohur edhe si TaqMan PCR, më poshtë referuar si FQ-PCR) është një teknologji e re sasiore e acidit nukleik e zhvilluar nga PE (Perkin Elmer) në Shtetet e Bashkuara në 1995. Kjo teknologji bazohet në PCR konvencionale duke shtuar sonda të etiketuara fluoreshente.Krahasuar me PCR fleksibël, FQ-PCR ka shumë përparësi për të realizuar funksionin e saj sasior.Ky artikull synon të përshkruajë shkurtimisht karakteristikat, parimet, metodat dhe aplikimet e teknologjisë.
1 Karakteristikat
FQ-PCR jo vetëm që ka ndjeshmërinë e lartë të PCR-së së zakonshme, por edhe për shkak të aplikimit të sondave fluoreshente, ai mund të zbulojë drejtpërdrejt ndryshimin e sinjalit fluoreshent gjatë amplifikimit PCR përmes sistemit të përcjelljes fotoelektrike për të marrë rezultate sasiore, gjë që kapërcen shumë mangësi të PCR-së konvencionale, kështu që ka edhe specifikën e lartë të teknologjisë dhe saktësinë e lartë të ADN-së hicurrosco.
Për shembull, produktet e përgjithshme PCR duhet të vëzhgohen me elektroforezë me xhel agarozë dhe ngjyrosje me bromid etidium me dritë ultravjollcë ose me elektroforezë me xhel poliakrilamid dhe ngjyrosje argjendi.Kjo jo vetëm që kërkon shumë instrumente, por gjithashtu kërkon kohë dhe përpjekje.Njollat e përdorura bromidi Ethidium është i dëmshëm për trupin e njeriut dhe këto procedura të komplikuara eksperimentale ofrojnë mundësi për ndotje dhe rezultate false.Megjithatë, FQ-PCR duhet të hapë kapakun vetëm një herë gjatë ngarkimit të kampionit, dhe procesi i mëvonshëm është funksionimi plotësisht me tub të mbyllur, i cili nuk kërkon post-përpunim PCR, duke shmangur shumë të meta në operacionet konvencionale të PCR.Eksperimenti në përgjithësi përdor cikluesin termik ABI7100 PCR të zhvilluar nga kompania PE.
Instrumenti ka karakteristikat e mëposhtme: ① Aplikim i gjerë: Mund të përdoret për përcaktimin e sasisë së produktit të ADN-së dhe ARN-së PCR, kërkimin e shprehjes së gjeneve, zbulimin e patogjenit dhe optimizimin e kushteve të PCR.② Parimi unik sasior: Duke përdorur sonda të etiketuara në mënyrë fluoreshente, sasia e fluoreshencës do të grumbullohet me ciklin PCR pas ngacmimit me lazer, në mënyrë që të arrihet qëllimi i kuantifikimit.③ Efikasitet i lartë i punës: Çiklues termik i integruar 9600 PCR, i kontrolluar nga kompjuteri 1 deri në 2 orë për të përfunduar amplifikimin dhe sasinë e 96 mostrave automatikisht dhe në mënyrë sinkrone.④ Nuk ka nevojë për elektroforezë xhel: Nuk ka nevojë për hollimin dhe elektroforezën e mostrës, thjesht përdorni një sondë speciale për të zbuluar drejtpërdrejt në tubin e reagimit.⑤Nuk ka ndotje në tubacion: Tubi unik i reagimit i mbyllur plotësisht dhe sistemi i përcjelljes fotoelektrike janë miratuar, kështu që nuk ka nevojë të shqetësoheni për ndotjen.⑥ Rezultatet janë të riprodhueshme: diapazoni sasior dinamik është deri në pesë rend të madhësisë.Prandaj, që kur kjo teknologji u zhvillua me sukses, ajo është vlerësuar nga shumë studiues shkencorë dhe është aplikuar në shumë fusha.
2 Parimet dhe metodat
Parimi i funksionimit të FQ-PCR është përdorimi i aktivitetit ekzonukleazë 5'→3' të enzimës Taq për të shtuar një sondë të etiketuar në mënyrë fluoreshente në sistemin e reagimit PCR.Sonda mund të hibridizohet në mënyrë specifike me shabllonin e ADN-së që gjendet në sekuencën e primerit.Fundi i 5' i sondës është etiketuar me gjenin e emetimit të fluoreshencës FAM (6-karboksifluoresceinë, kulmi i emetimit të fluoreshencës në 518 nm), dhe fundi 3' është etiketuar me grupin e shuarjes së fluoreshencës TAMRA (6-karboksitetrametrametilrodamine58, emetimi i fluoreshencës58, e sondës është fosforiluar për të parandaluar zgjatjen e sondës gjatë amplifikimit PCR.Kur sonda mbetet e paprekur, grupi shuarës shtyp emetimin e fluoreshencës të grupit emetues.Pasi grupi emetues ndahet nga grupi i shuarjes, frenimi ngrihet dhe densiteti optik në 518 nm rritet dhe zbulohet nga sistemi i zbulimit të fluoreshencës. Në fazën e rinatyrimit, sonda hibridizohet me ADN-në shabllon dhe enzima Taq në fazën e primerit të ADN-së lëviz përgjatë shtrirjes së shabllonit të ADN-së.Kur sonda është ndërprerë, efekti i shuarjes lirohet dhe sinjali fluoreshent lëshohet.Sa herë që shablloni kopjohet, një sondë ndërpritet, e shoqëruar me lëshimin e një sinjali fluoreshent.Meqenëse ekziston një lidhje një-për-një midis numrit të fluoroforeve të lëshuara dhe numrit të produkteve PCR, kjo teknikë mund të përdoret për të përcaktuar me saktësi sasinë e shabllonit.Instrumenti eksperimental në përgjithësi përdor cikluesin termik ABI7100 PCR të zhvilluar nga kompania PE, dhe mund të përdoren gjithashtu ciklistë të tjerë termikë.Nëse për eksperiment përdoret sistemi i reagimit të llojit të reagimit ABI7700, pas përfundimit të reaksionit, rezultatet sasiore mund të jepen drejtpërdrejt përmes analizës kompjuterike.Nëse përdorni ciklues të tjerë termik, duhet të përdorni një detektor fluoreshence për të matur sinjalin e fluoreshencës në tubin e reagimit në të njëjtën kohë për të llogaritur RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ përfaqëson raportin e intensitetit të lumineshencës së grupit të emetimit fluoreshent të tubit të kampionit me intensitetin e lumineshencës së grupit të shuarjes, RQ- përfaqëson raportin e të dyve në tubin bosh, △RQ (△RQ=RQ+-RQ+-sasia e të dhënave të përpunimit që përfaqëson ndryshimet fluoreshe gjatë procesit, sasia e rezultateve të përpunimit RQ+ mund të merret.Për shkak të futjes së sondave fluoreshente, specifika e eksperimentit është përmirësuar ndjeshëm.Dizajni i sondës në përgjithësi duhet të plotësojë kushtet e mëposhtme: ① Gjatësia e sondës duhet të jetë rreth 20-40 baza për të siguruar specifikën e lidhjes.②Përmbajtja e bazave GC është midis 40% dhe 60% për të shmangur dyfishimin e sekuencave të vetme nukleotide.③ Shmangni hibridizimin ose mbivendosjen me abetare.④ Stabiliteti i lidhjes midis sondës dhe shabllonit është më i madh se qëndrueshmëria e lidhjes midis primerit dhe shabllonit, kështu që vlera Tm e sondës duhet të jetë të paktën 5°C më e lartë se vlera Tm e abetares.Për më tepër, përqendrimi i sondës, homologjia midis sondës dhe sekuencës së shabllonit, dhe distanca midis sondës dhe primerit, të gjitha kanë një ndikim në rezultatet eksperimentale.
Produkte të ngjashme:
Kina në kohë reale PCR Easyᵀᴹ-Taqman Prodhuesi dhe Furnizuesi |Foregene (foreivd.com)
Koha e postimit: Tetor-15-2021
