Eksperimenti RT-qPCR përfshin nxjerrjen e ARN-së dhe vlerësimin e cilësisë, transkriptimin e kundërt dhe qPCR tre hapa, secili hap ka shumë masa paraprake, ne do t'ju prezantojmë në detaje më poshtë.

Ⅰ.Vlerësimi i cilësisë së ARN-së

Në eksperimentin RT-qPCR, pas përfundimit të nxjerrjes së ARN-së, cilësia e ARN-së duhet të vlerësohet dhe eksperimenti vijues mund të kryhet vetëm pasi të jetë kualifikuar.Metodat e vlerësimit përfshijnë spektrofotometrin, elektroforezën me xhel Agilent, analizën Agilent 2100, ndër të cilat zbulimi i metodës së elektroforezës së spektrofotometrit më të përdorur dhe xhelit të agarozës.Duhet të theksohet se këto dy metoda duhet të përdoren së bashku për të përfunduar zbulimin dhe analizën e përqendrimit, pastërtisë dhe integritetit të ARN-së, në mënyrë që të sigurohet cilësia e ARN-së.

Kompleti përkatës i izolimit të ARN-së: 

Kompleti i izolimit të ARN-së totale të qelizave

ARN totale shumë e pastruar dhe me cilësi të lartë mund të merret nga qeliza të ndryshme të kultivuara në 11 minuta.

Kompleti i izolimit total të ARN-së së Kafshëve

Ekstraktoni shpejt dhe me efikasitet ARN totale me pastërti të lartë dhe me cilësi të lartë nga inde të ndryshme të kafshëve.

Spektrofotometri:

Spektrofotometri përdoret kryesisht për të përcaktuar përqendrimin dhe pastërtinë e ARN-së, por nuk mund të zbulojë integritetin e ARN-së dhe mbetjet gjenomike.Midis tyre, A260/280 dhe A260/230 janë parametra të rëndësishëm për zbulimin e pastërtisë së ARN-së, dhe pastërtia e ARN-së mund të zbulohet sipas luhatjes së vlerave të tyre:

1. 1.9< A260/280< 2.1, që tregon se pastërtia e ARN-së është e mirë;A260/280<1.9, që tregon se mund të ketë mbetje proteinash në ARN;A260/280>2.1, që tregon degradimin e mundshëm të pjesshëm të ARN-së, i cili mund të konfirmohet më tej nga elektroforeza e xhelit të agarozës.

2. 2.0< A260/230< 2.2, që tregon se pastërtia e ARN-së është e mirë;A260/230< 2.0, që tregon se mund të ketë mbetje të reagentëve organikë në ARN, të tilla si fenole, etanol ose sheqerna.

Elektroforeza me xhel agaroze:

Analiza e elektroforezës së xhelit të agarozës mund të analizojë integritetin e ARN-së, gjenomin dhe mbetjet e proteinave, por nuk mund të përcaktojë saktë përqendrimin e ARN-së ose të zbulojë mbetjet e reagentëve organikë.Merrni për shembull shabllonet e ARN-së eukariote:

1. ARN-ja iu nënshtrua elektroforezës me xhel agarozë.Nëse kishte vetëm tre breza të vetëm të 28sARN, 18sARN dhe 5.8sARN në hartën e xhelit, kjo tregon se ARN-ja e nxjerrë është e paprekur.Nëse ka një fenomen zvarritjeje, ai tregon degradim të pjesshëm të ARN-së.

2. Nëse ka një brez të vetëm të ndritshëm midis vrimës së ngjitësit dhe brezit 28sARN, mund të ketë mbetje gjenomike të ADN-së.

3. Nëse shiritat shfaqen në vrimën e ngjitësit, kjo tregon se mund të ketë mbetje proteinash dhe substancash të tjera makromolekulare.

Ⅱ. Transkriptimi i kundërt

Pas përfundimit të nxjerrjes së ARN-së, ajo duhet të kthehet në cDNA për eksperimentet pasuese, kështu që hapi i kthimit është thelbësor.Transkriptimi i kundërt do të prezantohet nga përzgjedhja e transkriptazës së kundërt dhe primerit:

Zgjedhja e transkriptazës së kundërt:

Transkriptazat tipike të kundërta përfshijnë AMV RTase dhe MMLV RTase.RNase H e AMV RTase ka aktivitet të fortë, gjatësi të shkurtër sinteze, sasi të ulët sinteze dhe stabilitet të mirë termik (42 ~ 55 ℃).Aktiviteti RNase H i MMLV RTase është i dobët, gjatësia e sintezës është e gjatë, sasia e sintezës është e lartë dhe stabiliteti termik është i dobët (37 ~ 42 ℃).

Për shkak se enzima RNase H ka funksionin e degradimit të shabllonit të ARN-së, MMLV me aktivitet të dobët të RNase H duhet të zgjidhet në mënyrë preferenciale gjatë transkriptimit të kundërt, dhe pas inxhinierisë gjenetike të mëvonshme, stabiliteti termik i MMLV ka arritur një kërcim cilësor.Marrja e ForegeneTranskriptaza e kundërt Foreasy (M-MLV për transkriptimin e kundërt) si shembull, është një transkriptazë e re e kundërt e shprehur në bakteret e krijuara nga E. coli duke përdorur teknologjinë e rikombinimit gjenetik.Është një polimerazë ADN-je rekombinante që sintetizon një varg ADN-je plotësuese nga ARN, ADN, ose një hibrid ARN:ADN me një fije floku.Nuk ka aktivitet të RNase H, stabilitet të fortë, afinitet të fortë të ARN-së dhe ndjeshmëri të lartë zbulimi.

 

Transkriptaza e kundërt Foreasy (M-MLV për transkriptimin e kundërt)

Zgjedhja e primerit:

Në përgjithësi primerët RT ndahen në tre kategori: oligo dT, primerë të rastësishëm dhe primerë specifikë për gjen.Zgjidhni abetare të përshtatshme për përdorim sipas kërkesave të ndryshme eksperimentale.

1. Nëse shablloni është me origjinë eukariote dhe cDNA e vonë përdoret për amplifikimin rutinë PCR, rekomandohet Oligo (dT);Nëse eksperimenti i mëpasshëm përdoret vetëm për qPCR, Oligo (dT) rekomandohet të përzihet me primerë të rastësishëm për të përmirësuar efikasitetin e transkriptimit të kundërt.

2. Nëse shablloni është nga prokariotët, duhet të zgjidhen Primerë të rastësishëm ose primerë specifikë për gjen për transkriptim të kundërt.

Ⅲ.qPCR

Kuantifikimi i fluoreshencës është përpunuar kryesisht nga përzgjedhja e metodave sasiore, parimet e projektimit të primerit, përzgjedhja ROX, konfigurimi i sistemit të reagimit dhe përcaktimi i kushteve të reagimit, etj.

Zgjedhja e metodave sasiore:

Metodat sasiore ndahen në metoda sasiore relative dhe metoda sasiore absolute.Kuantifikimi relativ mund të përdoret për të zbuluar efektin e metodave të caktuara të trajtimit në shprehjen e gjeneve, për të zbuluar ndryshimin e shprehjes së gjeneve në periudha të ndryshme dhe për të krahasuar ndryshimin e shprehjes së gjeneve në inde të ndryshme.Kuantifikimi absolut mund të zbulojë sasinë e acidit nukleik në virus dhe kështu me radhë.Kur bëjmë eksperimente, ne duhet të zgjedhim metodat e duhura sasiore sipas eksperimenteve tona.

Parimet e projektimit të primerit:

Dizajni i primerit për qPCR lidhet drejtpërdrejt me efikasitetin e amplifikimit dhe specifikën e produktit.Prandaj, dizajnimi i saktë i primerëve të mirë është hapi i parë i qPCR të suksesshme.Në hartimin e primerit, duhet t'u kushtohet vëmendje parimeve të mëposhtme kur përmbushet parimi i dizajnit të primerit konvencional:

1. Gjatësia e fragmentit të synuar kontrollohet ndërmjet 100 dhe 300 bp;

2. Dizajni kryq-eksonik për të shmangur ndikimin e ADN-së gjenomike;

3. Primerët e projektuar duhet të testohen për efikasitetin e amplifikimit dhe vetëm kur efikasiteti i amplifikimit të arrijë standardin (90-110%) mund të përdoren për eksperimente sasiore;

4. Përqendrimi i primerit zakonisht optimizohet ndërmjet 0.1uM dhe 1.0uM.

Përzgjedhja eROX:

Në procesin e reagimit sasior, ROX mund të rregullojë në mënyrë uniforme ndryshimin e rrugës optike, gabimin e pipetimit ose ndryshimin e vëllimit të shkaktuar nga avullimi dhe kondensimi, duke përmirësuar përsëritshmërinë e rezultateve.Sidoqoftë, duhet të theksohet se zgjedhja e ROX lidhet me instrumentin.Nëse instrumenti qPCR ka funksionin e korrigjimit automatik të diferencës midis vrimave, nuk ka nevojë të shtojë ROX;përndryshe, duhet të shtojë korrigjimin ROX.Partnerët e vegjël në blerjen e reagentëve duhet të jenë sipas instrumentit të përdorur për të zgjedhur ROX-in e duhur, për të shmangur gabimet e mëvonshme.

Përgatitja e sistemit të reagimit:

Preferohen vëllimet e reagimit prej 20 ul dhe 50 ul.Kur formulohet sistemi, duhet t'u kushtohet vëmendje çështjeve të mëposhtme:

1. Sistemi i reagimit duhet të përgatitet me ventilim në tavolinën e punës ultra të pastër, ddH e re₂O përdoret për çdo eksperiment;

2. Çdo eksperiment duhet të përgatisë NTC për të verifikuar nëse ka ndotje në sistem dhe çdo çift abetaresh duhet të bëjë NTC kur përgatit sistemin;

3. Për të zbuluar nëse ka mbetje gADN në shabllonin e ARN-së, NRT mund të përgatitet për çdo mostër për zbulim;

4. Gjatë përgatitjes së sistemit, rekomandohet të bëhen të paktën 3 përsëritje teknike për një mostër;

5. Kur shablloni është cDNA, rekomandohet të hollohet 5-10 herë për të reduktuar efektin e frenimit të sistemit të transkriptimit të kundërt në eksperimentin qPCR.Është më mirë të eksplorohet sasia e shabllonit sipas gradientit, në mënyrë që vlera e CT të bjerë midis 20-30;

6. Përcaktoni numrin e kërkuar të reaksioneve, rriteni me 5-10% në bazë të numrit të reaksioneve dhe llogaritni numrin e konfigurimit të vëllimit;

7, sistemi përgatitet duke përdorur parimin e parapërzierjes, duke u përzier pas centrifugimit dhe duke siguruar që të mos ketë flluska;

8, Sa më shumë të jetë e mundur për të zgjedhur materialet harxhuese mbështetëse.

Kompleti i lidhur RT-qPCR