Specifikimi i zbulimit

Në shumicën e rasteve, qëllimi i dizajnit të primerit është të maksimizojë specifikën e PCR.Kjo përcaktohet nga ndikimi pak a shumë i parashikueshëm i shumë variablave.Një variabël i rëndësishëm është sekuenca në fundin 3 të abetares.

E rëndësishmja, analizat PCR të dizajnuara për specifikat kanë më shumë gjasa të mbajnë efikasitet të lartë në një gamë të gjerë dinamike, sepse analiza nuk prodhon produkte jospecifike të amplifikimit, duke konkurruar kështu me reagentët PCR ose duke penguar reaksionin kryesor të amplifikimit.

Sigurisht, në disa raste, specifika nuk është më e rëndësishmja, për shembull, kur qëllimi është të përcaktojë sasinë e patogjenëve të lidhur ngushtë, por të ndryshëm, kërkohen standarde të veçanta dizajni, optimizimi dhe verifikimi.

Kurba e shkrirjes është një metodë standarde për vlerësimin e specifikës së amplikoneve, të paktën për sa i përket amplifikimit të një objektivi të vetëm.Megjithatë, duhet theksuar se kthesat e shkrirjes mund të jenë mashtruese sepse, për shembull, ato mund të ndikohen nga efektet e kombinuara të primerëve jooptimal dhe përqendrimeve të ulëta të shabllonit.

P5 |Kurba e shkrirjes tregon zhvendosjet Tm të marra nga dy zbulime të sasive të ndryshme të dy ADN-ve të synuara.

A. Në përqendrime më të larta (ad)), nuk ka dimer të dukshëm primer pas përfundimit të matjes qPCR.Ndërsa përqendrimi i shabllonit zvogëlohet në 50 kopje (e), një produkt jo specifik fillon të shfaqet dhe bëhet produkti i vetëm në përqendrimin më të ulët (f).

B. Testi regjistroi të njëjtat Tms në të gjitha përqendrimet e synuara dhe nuk kishte dimer të dukshëm primer edhe në përqendrimin më të ulët (5 kopje).Kur përdorni këto dy metoda zbulimi, nuk u zbuluan produkte amplifikuese në NTC.

P5 tregon lakoret e shpërbërjes të marra me mostrat në të cilat shablloni është i pranishëm në përqendrime të ndryshme.P 5a tregon se në dy përqendrimet më të ulëta, Tms e produkteve të amplifikimit jospecifik të prodhuar janë më të ulëta se ato të amplikoneve specifike.

Natyrisht, kjo metodë zbulimi nuk mund të përdoret në mënyrë të besueshme për të zbuluar objektivat që ekzistojnë në përqendrime të ulëta.

Është interesante se NTC-të, dmth, mostrat pa ADN fare, nuk regjistrojnë produkte (jo specifike) të amplifikimit, duke treguar se ADN-ja gjenomike e sfondit mund të marrë pjesë në amplifikimin/polimerizimin jospecifik.

Ndonjëherë këto primera të sfondit dhe amplifikimi jo specifik nuk mund të korrigjohen, por shpesh është e mundur të hartohet një metodë zbulimi që nuk ka amplifikimin jospecifik në asnjë përqendrim shabllon dhe NTC (P 5b).

Këtu, edhe regjistrimi i amplifikimit të përqendrimit të synuar me një Cq prej 35 do të prodhojë një kurbë specifike shpërbërjeje.Në mënyrë të ngjashme, NTC nuk treguan shenja të amplifikimit jospecifik.Ndonjëherë, sjellja e zbulimit mund të varet nga lëngu amë dhe vetëm përforcim jospecifik zbulohet në përbërje të caktuara buferike, të cilat mund të lidhen me përqendrime të ndryshme Mg2+.

Stabiliteti i zbulimit

Optimizimi i Ta është një hap i dobishëm në verifikimin empirik dhe procesin e optimizimit të zbulimit qPCR.Ai siguron një tregues të drejtpërdrejtë të qëndrueshmërisë së grupit të primerit duke treguar temperaturën (ose diapazonin e temperaturës) që prodhon Cq më të ulët pa amplifikuar NTC.

Diferenca dy deri në katërfish në ndjeshmëri mund të mos jetë e rëndësishme për njerëzit me shprehje të lartë të mRNA, por për testet diagnostike, mund të nënkuptojë ndryshimin midis rezultateve pozitive dhe atyre të rreme negative.

Vetitë Ta të primerëve qPCR mund të ndryshojnë shumë.Disa teste nuk janë shumë të forta dhe nëse nuk kryhen nën vlerën optimale Ta të abetareve, ato shpejt do të shemben.

Kjo është e rëndësishme sepse ky lloj zbulimi është shpesh problematik në botën reale dhe pastërtia e kampionit, përqendrimi i ADN-së ose prania e ADN-së tjetër mund të mos jenë optimale.

Për më tepër, numri i kopjes së synuar mund të ndryshojë në një gamë të gjerë dhe reagentët, veglat plastike ose instrumentet mund të jenë të ndryshëm nga ato të përdorura gjatë konfigurimit të testit.

P6|Gradienti i temperaturës tregon qëndrueshmërinë e ndryshme të zbulimit të PCR.

A. Përdorni Mastermix Sensifast SYBR të Bioline (numri i katalogut BIO-98050) për të kryer PCR në cDNA të përgatitur nga ARN e trurit të njeriut.

B. Përdorni instrumentin CFX qPCR të Bio-Rad për të regjistruar hartën e amplifikimit dhe kurbën e shpërbërjes së apalenit (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. Grafiku i amplifikimit dhe kurba e shkrirjes së ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. Grafiku i amplifikimit dhe kurba e shpërbërjes së GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCTCTCGTGGATCTTC).

E. Cqs të regjistruara në temperatura të ndryshme pjekjeje, duke treguar ndryshimin në Cq të regjistruar nën një gradient të temperaturës 7C.

P 6 tregon një rezultat tipik të një testi të padëshiruar, ku qPCR u krye duke përdorur një gradient Tas midis 59C dhe 67C (P 6a), duke përdorur abetare për tre gjene specifike për trurin e njeriut.

Mund të shihet nga grafiku i amplifikimit se primerët Opalin janë larg idealit sepse diapazoni i tyre optimal Ta është shumë i ngushtë (Figura 6b), domethënë, Cqs janë gjerësisht të shpërndarë, duke rezultuar në krahasimin e dukshëm të Cq me Cqs të ulët të tyre optimal.

Kjo metodë zbulimi është e paqëndrueshme dhe mund të çojë në përforcim jo optimal.Prandaj, kjo palë abetaresh duhet të ridizajnohet.Përveç kësaj, analiza e kurbës së shkrirjes (inset) tregon se specifika e kësaj metode zbulimi mund të jetë gjithashtu problematike, sepse kurba e shkrirjes së çdo Ta është e ndryshme.

Metoda e zbulimit ACSBG1 e treguar në P 6c është më e fuqishme se metoda e zbulimit Opalin më sipër, por është ende larg idealit dhe ka të ngjarë që mund të përmirësohet.

Megjithatë, theksojmë se nuk ka lidhje të nevojshme midis qëndrueshmërisë dhe specifikës, sepse kurba e shpërbërjes e prodhuar nga kjo metodë zbulimi tregon të njëjtën vlerë kulmore në të gjitha Tas (inset).

Nga ana tjetër, testi i qëndrueshmërisë është shumë më tolerant, duke prodhuar Cq të ngjashëm në një gamë të gjerë Tas, si në testin GFAP të treguar në P 6d.

Dallimi në Cqs të përftuar në të njëjtin interval prej 8 gradë Celsius është më pak se 1 dhe kurba e shpërbërjes (inset) konfirmon karakteristikat e zbulimit në këtë interval të temperaturës.Vlen të përmendet se Tas e llogaritur dhe diapazoni aktual Ta mund të jenë shumë të ndryshme.

Ka shumë udhëzime të dizajnuara për të ndihmuar kërkuesit të krijojnë abetare efikase, shumica e të cilave bazohen në rregulla të vendosura prej kohësh dhe shumë vëmendje i është kushtuar fundit të 3' të abetareve.Shpesh rekomandohet që të përfshihet një G ose C në skajin 3' dhe dy baza G ose C (kampa GC), por jo më shumë se dy nga 5 bazat e fundit.

Në praktikë, këto rregulla mund t'i udhëheqin studiuesit, por ato nuk janë domosdoshmërisht të sakta në të gjitha rrethanat.

P7 |Fundi 3 i abetares ka pak efekt në specifikën ose efikasitetin.

A. Pozicioni i primerëve për gjenin human HIF-1α (NM_181054.2).

B. Përdorni Agilent Brilliant III SYBR Liquor amtare Green (Kat. Nr. 600882) për të përforcuar gjashtë artikuj provë.

C. Grafiku i amplifikimit dhe kurba e shkrirjes e regjistruar nga instrumenti CFX qPCR i Bio-Rad dhe primerët 3'.NTC-të tregohen me të kuqe.

D. Regjistrimi Cqs i çdo artikulli testues

Për shembull, rezultati në P 7 bie ndesh me rregullin 3'fund.Të gjitha modelet prodhojnë në thelb të njëjtat rezultate, me vetëm dy kombinime primerash që çojnë në përforcim jo specifik në NTC.

Megjithatë, ne nuk mund të mbështesim efektin e klipit GC, sepse në këtë rast, përdorimi i A ose T si maksimumi 30 baza nuk e zvogëlon specifikën.

Testi C, ku abetarja F përfundon në GGCC, regjistroi Cq në NTC, duke treguar se dikush mund të dëshirojë të shmangë këto sekuenca në fundin 30.Theksojmë se mënyra e vetme për të përcaktuar sekuencën më të mirë 3' të një çifti primerësh është të vlerësohen eksperimentalisht disa abetare kandidate.

Efikasiteti i amplifikimit

E rëndësishmja, megjithëse zbulimi jo-specifik PCR nuk mund të bëhet kurrë specifik, efikasiteti i amplifikimit mund të rregullohet dhe maksimizohet në shumë mënyra të ndryshme duke ndryshuar enzimën, lëngun e nënës, aditivët dhe kushtet e ciklit.

Për të vlerësuar efikasitetin e zbulimit të PCR, është më mirë të përdoret një hollim serik prej 10 ose 5 herë më shumë se acidi nukleik i synuar, domethënë "metoda standarde e kurbës".

Nëse amplikonet e PCR ose objektivat sintetikë të ADN-së përdoren për të gjeneruar një kurbë standarde, hollimet serike të këtyre objektivave duhet të përzihen me një sasi konstante të ADN-së së sfondit (si ADN-ja gjenomike).

P8 |Kurba e hollimit për të vlerësuar efikasitetin e PCR.

A. Përdorni primerët për HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA dhe R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC dhe Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (numri i katalogut 600882) për PCR dhe kushtet e kurbës së shkrirjes.

B. 100 ng ARN u transkriptua anasjelltas, u hollua 2 herë dhe mostrat e cDNA të holluara në mënyrë serike u holluan 5 herë në 1 ng ADN gjenomike njerëzore.Kurba e shkrirjes tregohet në hyrje.

C. Reagimi RT, hollimi dhe hollimi serik u përsëritën për kampionin e dytë të cADN-së dhe rezultatet ishin të ngjashme.

P 8 tregon dy kthesa standarde, duke përdorur të njëjtën metodë zbulimi në dy mostra të ndryshme cDNA, rezultati është i njëjti efikasitet, rreth 100%, dhe vlera R2 është gjithashtu e ngjashme, domethënë, shkalla e përshtatjes midis të dhënave eksperimentale dhe vijës së regresionit ose shkalla e linearitetit të të dhënave.

Dy kthesat standarde janë të krahasueshme, por jo saktësisht të njëjta.Nëse qëllimi është të përcaktojë saktë objektivin, duhet të theksohet se është e papranueshme të sigurohet një llogaritje e numrit të kopjeve pa shpjeguar pasigurinë

P9 |Pasiguria e matjes e lidhur me kuantifikimin duke përdorur një kurbë standarde.

A. Përdorni primerë për GAPDH (NM_002046) për të kryer PCR dhe kushtet e kurbës së shkrirjes.F: ACAGTTGCCATGTAGACC dhe R: TAACTGGTTGAGCACAGG dhe mastermiksi Sensifast SYBR i Bioline (numri i katalogut BIO-98050).

B. Grafiku i amplifikimit, kurba e shkrirjes dhe kurba standarde e regjistruar me instrumentin CFX qPCR të Bio-Rad.

C. Grafiku i kurbës standarde dhe intervali i besueshmërisë 95% (CI).

D. Numri i kopjes dhe intervali i besueshmërisë 95% të tre vlerave Cq që rrjedhin nga kurba e hollimit.

P 9 tregon se për një test të optimizuar, ndryshueshmëria e qenësishme e një kurbë të vetme standarde është afërsisht 2 herë (95% interval besimi, minimumi në maksimum), që mund të jetë ndryshueshmëria më e vogël që mund të pritet.

Produkt i ngjashëm:

Kompleti Cell Direct RT qPCR

Kit PCR Direct Tail Mouse

Kompleti PCR i drejtpërdrejtë i indeve të kafshëve