Dihet mirë se në dogmën qendrore, ARN është ndërmjetësi transkriptues ndërmjet shprehjes së ADN-së dhe proteinave.Krahasuar me zbulimin e ADN-së, zbulimi i ARN-së mund të pasqyrojë në mënyrë më objektive shprehjen e gjeneve në organizma.Eksperimentet që përfshijnë ARN përfshijnë: qRT-PCR, ARN-Seq dhe zbulimin e gjenit të shkrirjes, etj. Bazuar në karakteristikat e vetë ARN-së (unaza e sheqerit e ARN-së ka një grup hidroksil më të lirë se unaza e sheqerit e ADN-së), e shoqëruar me një numër të madh RNase në mjedis, ARN është më e paqëndrueshme dhe më e lehtë për t'u degraduar se ADN.Plehrat brenda, mbeturinat jashtë, nëse cilësia e ARN-së nuk është e mirë, atëherë rezultatet eksperimentale duhet të jenë të pakënaqshme, veçanërisht të manifestuara si të dhëna të pasakta ose përsëritshmëri të dobët.Prandaj, më shumë vëmendje duhet t'i kushtohet përpunimit të ARN-së, dhe lidhja e kontrollit të cilësisë është gjithashtu më e rëndësishme për të siguruar saktësinë dhe saktësinë e të dhënave të mëvonshme eksperimentale.

Për kontrollin e cilësisë së ARN-së, zakonisht përdoren metodat e mëposhtme:

• Spektrofotometria
• elektroforeza me xhel agarozë
• Bianalizues i shkathët
• PCR sasiore fluoreshente në kohë reale
• Metoda e ngjyrosjes fluoreshente Qubit

01 Spektrofotometri

ARN ka lidhje të dyfishta të konjuguara dhe ka një kulm përthithjeje në një gjatësi vale prej 260 nm.Sipas ligjit të Lambert-Beer-it, ne mund të llogarisim përqendrimin e ARN-së nga kulmi i përthithjes në 260 nm.Përveç kësaj, ne gjithashtu mund të llogarisim pastërtinë e ARN-së sipas raportit të majave të përthithjes 260 nm, 280 nm dhe 230 nm.280 nm dhe 230 nm janë respektivisht maja e përthithjes së proteinave dhe molekulave të vogla.Raporti i pastërtisë së ARN-së të kualifikuar të A260/A280 dhe A260/A230 duhet të jetë më i madh se 2. Nëse është më pak se 2, do të thotë se ka ndotje me proteina ose molekula të vogla në kampionin e ARN-së dhe duhet të pastrohet përsëri.Burimet e kontaminimit do të ndikojnë në eksperimentet e rrjedhës së poshtme, të tilla si frenimi i efikasitetit të amplifikimit të reaksioneve PCR, duke rezultuar në rezultate sasiore të pasakta.Pastërtia e ARN-së ka një ndikim të madh në rezultatet e mëvonshme, kështu që spektrofotometria është përgjithësisht një lidhje e domosdoshme e kontrollit të cilësisë në hapin e parë në eksperimentet e acidit nukleik.

Figura 1. Spektri tipik i absorbimit të ARN/ADN-së

02 Elektroforeza me xhel agaroze

Përveç pastërtisë, integriteti i ARN-së është gjithashtu një nga treguesit e rëndësishëm për të gjykuar cilësinë e ARN-së.Degradimi i ARN do të çojë në një numër të madh të fragmenteve të shkurtra në mostër, kështu që numri i fragmenteve të ARN-së që mund të zbulohen në mënyrë efektive dhe të mbulohen nga sekuenca e referencës do të reduktohet.Integriteti i ARN-së mund të kontrollohet me elektroforezë të ARN-së totale në një xhel agarozë 1%.Kjo metodë mund ta konfigurojë vetë xhelin ose të përdorë sistemin e parafabrikuar E-Gel™ për testimin e integritetit.Më shumë se 80% e ARN-së totale është ARN ribozomale, pjesa më e madhe e së cilës përbëhet nga ARN 28S dhe 18S (në sistemet e gjitarëve).ARN me cilësi të mirë do të tregojë dy shirita të shndritshëm të dukshëm, të cilët janë shirita të shndritshëm 28S dhe 18S, respektivisht, në 5 Kb dhe 2 Kb, dhe raporti do të priret të jetë afër 2:1.Nëse është në gjendje difuze, do të thotë se kampioni i ARN-së mund të jetë degraduar dhe rekomandohet përdorimi i metodës së përshkruar më vonë për të testuar më tej cilësinë e ARN-së.

Figura 2. Krahasimi i ARN-së së degraduar (korsi 2) dhe i paprekur (korsi 3) në elektroforezën e xhelit të agarozës

03 Bianalizues i shkathët

Përveç metodës së elektroforezës së xhelit të agarozës të përshkruar më sipër, e cila mund të na ndihmojë të identifikojmë integritetin e ARN-së thjesht dhe shpejt, ne mund të përdorim edhe bianalizuesin Agilent për të përcaktuar integritetin e ARN-së.Ai përdor një kombinim të mikrofluidikës, elektroforezës kapilare dhe fluoreshencës për të vlerësuar përqendrimin dhe integritetin e ARN-së.Duke përdorur algoritmin e integruar për të analizuar profilin e kampionit të ARN-së, bioanalizuesi Agilent mund të llogarisë një vlerë të integritetit të ARN-së referuese, Numri i Integritetit të ARN-së (më tej referuar si RIN) [1].Sa më e madhe të jetë vlera e RIN, aq më i lartë është integriteti i ARN-së (1 është jashtëzakonisht i degraduar, 10 është më i plotë).Disa eksperimente që përfshijnë ARN sugjerojnë përdorimin e RIN si një parametër për vlerësimin e cilësisë.Duke marrë si shembull eksperimentet e renditjes me performancë të lartë (në tekstin e mëtejmë të referuar si NGS), udhëzimet e Repertorit të imunitetit të njeriut Oncomine™, i cili përdoret për të zbuluar receptorët e antigjenit të qelizave B dhe të qelizave T në serinë e paneleve Oncomine të Thermo Fisher, sugjerojnë që mostrat me vlera RIN më të mëdha se 4, mund të lexohen matje më të efektshme Fig.Ka intervale të ndryshme të rekomanduara për panele të ndryshme dhe shpesh një RIN më i lartë mund të sjellë të dhëna më efektive.

Figura 3, në eksperimentet e Repertorit Imun të Njeriut Oncomine™, mostrat me RIN më të madh se 4 mund të zbulojnë lexime më efektive dhe klone të qelizave T.【2】

Megjithatë, vlera RIN ka gjithashtu disa kufizime.Megjithëse RIN ka një korrelacion të lartë me cilësinë e të dhënave eksperimentale NGS, ai nuk është i përshtatshëm për mostrat FFPE.Mostrat FFPE janë trajtuar kimikisht për një kohë të gjatë, dhe ARN-ja e nxjerrë në përgjithësi ka një vlerë relativisht të ulët RIN.Megjithatë, kjo nuk do të thotë se të dhënat efektive të eksperimentit duhet të jenë të pakënaqshme.Për të vlerësuar me saktësi cilësinë e mostrave FFPE, duhet të përdorim matje të tjera përveç RIN.Përveç RIN, bioanalizuesi Agilent mund të llogarisë gjithashtu vlerën DV200 si një parametër vlerësimi i cilësisë së ARN-së.DV200 është një parametër që llogarit proporcionin e fragmenteve më të mëdha se 200 bp në një kampion ARN.DV200 është një tregues më i mirë i cilësisë së mostrës FFPE sesa RIN.Për ARN-në e nxjerrë nga FFPE, ajo ka një korrelacion shumë të lartë me numrin e gjeneve që mund të zbulohen në mënyrë efektive dhe diversitetin e gjeneve [3].Megjithëse DV200 mund të plotësojë mangësitë në zbulimin e cilësisë së FFPE, bioanalizuesi Agilent ende nuk mund të analizojë plotësisht problemet e cilësisë në mostrat e ARN-së, duke përfshirë nëse ka frenues në mostra.Vetë frenuesit mund të ndikojnë në efikasitetin e amplifikimit të eksperimenteve në rrjedhën e poshtme dhe të zvogëlojnë sasinë e të dhënave të dobishme.Për të ditur nëse ka një frenues në mostër, ne mund të adoptojmë metodën sasiore fluoreshente PCR në kohë reale të përshkruar më poshtë.

04 PCR sasiore fluoreshente në kohë reale

Metoda sasiore fluoreshente PCR në kohë reale jo vetëm që mund të zbulojë frenuesit në kampion, por gjithashtu pasqyron me saktësi cilësinë e ARN-së në kampionin FFPE.Krahasuar me analizuesit biologjikë Agilent, instrumentet sasiore të fluoreshencës në kohë reale janë më të njohura në laboratorët kryesorë biologjikë për shkak të aplikimit të tyre më të gjerë.Për të testuar cilësinë e mostrave të ARN-së, na duhet vetëm të blejmë ose të përgatisim sonda primer për gjenet e brendshme të referencës, si GUSB (Nr. Cat. Hs00939627).Duke përdorur këtë grup abetaresh, sondash dhe standardesh (ARN totale me përqendrim të njohur) për të kryer eksperimente sasiore absolute, përqendrimi efektiv i fragmentit të ARN-së mund të llogaritet si standard vlerësimi i cilësisë së ARN-së (Funksional ARN Quantitation (FRQ) shkurtimisht).Në një test NGS, ne zbuluam se FRQ e mostrave të ARN-së ka një korrelacion shumë të lartë me vëllimin efektiv të të dhënave.Për të gjitha mostrat më të mëdha se 0,2 ng/uL FRQ, të paktën 70% e leximeve mund të mbulojnë në mënyrë efektive sekuencën e referencës (Figura 4).

Figura 4, vlera FRQ e zbuluar me metodën sasiore të fluoreshencës ka një korrelacion shumë të lartë (R2>0.9) me të dhënat efektive të marra në eksperimentin NGS.Vija e kuqe është vlera FRQ e barabartë me 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

Përveçse është e zbatueshme për mostrat FFPE, metoda sasiore PCR në kohë reale mund të monitorojë në mënyrë efektive frenuesit në mostra.Ne mund të shtojmë kampionin që do të zbulohet në sistemin e reaksionit me Kontrollin e Brendshëm Pozitiv (IPC) dhe Analizën e tij, dhe më pas të kryejmë kuantifikimin e fluoreshencës për të marrë vlerën Ct.Nëse vlera Ct mbetet pas vlerës Ct në reaksionin pa mostër, kjo tregon se frenuesi është i pranishëm në mostër dhe frenon efikasitetin e amplifikimit në reaksion.

05 Metoda e ngjyrosjes fluoreshente Qubit

Fluorometri Qubit është pajisja e vogël më e përdorur për zbulimin e përqendrimit dhe pastërtisë së acidit nukleik, e cila është e lehtë për t'u përdorur dhe ekziston pothuajse në çdo laborator të biologjisë molekulare.Llogarit me saktësi përqendrimin e acidit nukleik duke zbuluar dhe ngjyrën fluoreshente që lidh acidin nukleik (reagenti i zbulimit Qubit).Qubit ka ndjeshmëri dhe specifikë të lartë dhe mund të përcaktojë me saktësi sasinë e ARN-së deri në përqendrimin pg/µL.Përveç aftësisë së njohur për të përcaktuar me saktësi përqendrimin e acidit nukleik, modeli i ri i fundit i Thermo Fisher, Qubit 4.0, mund të zbulojë gjithashtu integritetin e ARN-së.Sistemi i zbulimit të ARN-së së Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) zbulon integritetin e ARN-së duke zbuluar njëkohësisht dy ngjyra specifike fluoreshente.Këto dy ngjyra fluoreshente mund të lidhen përkatësisht me fragmente të mëdha dhe fragmente të vogla të ARN-së.Këto dy ngjyra fluoreshente tregojnë proporcionin e fragmenteve të mëdha të ARN-së në mostër dhe nga kjo mund të llogaritet vlera e IQ (Integriteti dhe Cilësia) që përfaqëson cilësinë e ARN-së.Vlera e IQ është e zbatueshme si për mostrat FFPE ashtu edhe për ato jo-FFPE dhe ka një ndikim të madh në cilësinë e renditjes pasuese.Duke marrë si shembull eksperimentet NGS, në eksperimentet e testit RNA-Seq të kryera në platformën Jon torrent™, shumica e mostrave me vlera IQ më të mëdha se 4 kishin të paktën 50% lexime efektive (Figura 5).Krahasuar me metodat e lartpërmendura të zbulimit, Qubit IQ Assay jo vetëm që është më i përshtatshëm për t'u përdorur dhe kërkon më pak kohë (brenda pesë minutave), por gjithashtu ka një korrelacion të madh midis vlerës së parametrit të matur IQ dhe cilësisë së të dhënave të eksperimenteve në rrjedhën e poshtme.

Figura 5, ekziston një korrelacion i madh midis vlerës së Qubit ARN IQ dhe leximeve të hartuara të ARN-Seq.【5】

Nëpërmjet hyrjes së mësipërme, unë besoj se të gjithë kanë një kuptim të mjaftueshëm të metodave të ndryshme të kontrollit të cilësisë së ARN-së.Në praktikë, ju mund të zgjidhnimetodën përkatëse sipas llojit të mostrës dhe instrumenteve ekzistuese.Vetëm duke kontrolluar mirë cilësinë e ARN-së mund të shmangim dështimin e eksperimenteve të mëvonshme të shkaktuara nga cilësia e dobët e mostrës, duke kursyer kështu kohë, energji dhe kosto të çmuar.

Produkte referuese:

Kompleti i izolimit total të ARN-së së Kafshëve

Kompleti i izolimit të ARN-së totale të qelizave

referencat

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: një numër i integritetit të ARN-së për caktimin e vlerave të integritetit në matjet e ARN-së.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Udhëzuesi i përdorimit të repertorit të imunitetit të njeriut Oncomine (Nr. botimi MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Metrikat e përmirësuara të cilësisë për vlerësimin e ARN-së të përftuara nga mostrat arkivore të indeve të ngulitura në formalinë të fiksuar në parafinë, Shkenca toksikologjike 29, August 17, Shkencat Isokologjike17, 57–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/