1. Zbuloni absorbimin e tretësirës së ARN-së
Absorbimi në 280, 320, 230 dhe 260 nm përfaqëson respektivisht vlerat e acidit nukleik, sfondit (turbulltësisë së tretësirës), përqendrimit të kripës dhe lëndës organike si proteina.Në përgjithësi shikoni vetëm OD260/OD280 (Raporti, R).Kur 1,8~2,0, mendojmë se mund të tolerohet kontaminimi i proteinave ose lëndëve të tjera organike në ARN, por duhet theksuar se kur Tris përdoret si tampon për të zbuluar absorbimin, vlera R mund të jetë më e madhe se 2 (në përgjithësi duhet të jetë <2,2).Kur R<1.8, ndotja e proteinave ose lëndëve të tjera organike në tretësirë është më e dukshme dhe fati i ARN-së mund të përcaktohet sipas nevojave.Kur R>2.2, do të thotë që ARN është hidrolizuar në acid të vetëm nukleik.
2. Modeli elektroforetik i ARN
Në përgjithësi, xhel denatyrues përdoret për elektroforezën e ARN-së, por nëse është vetëm për zbulimin e cilësisë së ARN-së, xhel denatyrues nuk është i nevojshëm dhe mund të përdoret xhel i zakonshëm agarozë.Qëllimi i elektroforezës është të zbulojë integritetin e brezave 28S dhe 18S dhe raportin e tyre, ose integritetin e njollosjes së mRNA.Në përgjithësi, nëse brezat 28S dhe 18S janë të shndritshëm, të qartë dhe të mprehtë (duke iu referuar skajeve të brezave janë të qarta), dhe shkëlqimi i 28S është më shumë se dyfishi i brezit 18S, ne e konsiderojmë cilësinë e ARN-së si të mirë.
Më sipër janë dy metodat që përdorim zakonisht, por asnjëra nga këto dy metoda nuk mund të na tregojë qartë nëse ka RNase të mbetur në tretësirën e ARN-së.Nëse ka një sasi shumë të vogël të RNase në tretësirë, është e vështirë për ne ta zbulojmë atë me metodën e mësipërme, por shumica e reaksioneve enzimatike të mëvonshme kryhen në mbi 37 gradë dhe për një kohë të gjatë.Në këtë mënyrë, nëse ka një sasi shumë të vogël të RNase në tretësirën e ARN-së, atëherë do të ketë një mjedis dhe kohë shumë të përshtatshme për të luajtur rolin e tyre në eksperimentet e mëpasshme dhe sigurisht që eksperimenti do të jetë i ftohtë në këtë kohë.Më poshtë prezantojmë një metodë që mund të konfirmojë nëse ka RNazë të mbetur në tretësirën e ARN-së.
3. Testi i ruajtjes së nxehtësisë
Sipas përqendrimit të kampionit, nxirrni dy ARN 1000 ng nga tretësira e ARN-së dhe shtoni në një tub centrifuge 0.5 ml dhe plotësoni atë me pH 7.0 Tris bufer në një vëllim total prej 10 ul dhe më pas mbyllni kapakun e tubit.Vendoseni njërën prej tyre në një banjë uji me temperaturë konstante në 70°C dhe mbajeni të ngrohtë për 1 orë.Pjesa tjetër ruhet në frigorifer -20°C për 1 orë.Kur të mbarojë koha, hiqni dy mostrat për elektroforezë.Pas përfundimit të elektroforezës, krahasoni brezat elektroforetikë të të dyjave.Nëse brezat e të dyjave janë konsistente ose nuk kanë dallime domethënëse (natyrisht, brezat e tyre plotësojnë gjithashtu kushtet në metodën 2), do të thotë se nuk ka kontaminim të mbetur nga RNase në tretësirën e ARN-së dhe cilësia e ARN-së është shumë e mirë.Përkundrazi, nëse kampioni i inkubuar në 70°C tregon degradim të dukshëm, kjo tregon se ka kontaminim me RNase në tretësirën e ARN-së.
2 Metoda dhe teknika eksperimentale për nxjerrjen e ARN-së
Problemet që hasim shpesh gjatë nxjerrjes së ARN-së janë: (1) Rendimenti i ARN-së është i ulët;(2) ARN ka ndotje serioze me kripë;(3) ARN ka ndotje serioze me tretës organik;(4) degradimi i mostrës dhe probleme të tjera
1. Reagentët e ekstraktimit total të ARN-së që përdoren zakonisht
Metoda e izotiocianatit të guanidinës dhe metoda Trizol janë metodat më të përdorura për nxjerrjen e ARN-së totale nga indet e kafshëve dhe qelizat shtazore.Ai është veçanërisht i përshtatshëm për mostra të vogla dhe inde që janë veçanërisht të vështira për t'u nxjerrë, siç është nxjerrja e ARN-së totale nga lëkura e lepurit dhe indi lidhor i kafshëve;Përveç kësaj, Trizol, si një reagent për lizë për përdorim të përgjithshëm, mund të përdoret gjithashtu për nxjerrjen e indeve bimore, baktereve, kërpudhave dhe indeve të tjera.Për indet bimore që përmbajnë polisakaride dhe polifenole, si camellia oleifera, gjethet e çajit, farat e rapit, etj., metoda CTAB mund të përdoret gjithashtu për të nxjerrë ARN totale.
Si një metodë konvencionale, metoda me dy kolona është gjithashtu shumë e popullarizuar për shkak të funksionimit të saj normal të temperaturës, pa nevojën për të shtuar RNase dhe sigurinë - pa kloroform, fenole dhe reagentë të tjerë organikë për ekstraktim.(produktet e rekomanduara )
2. Nxjerrja e ARN totale nga indet e kafshëve
(1) Përpiquni të zgjidhni pecetë të freskët, nëse nuk është i freskët (mundësisht brenda tre muajve - frigorifer 80 ℃ ose i ngrirë në azot të lëngshëm. Gjatë prerjes së indeve, mos e prisni direkt në temperaturën e dhomës, sigurohuni që ta vendosni në kutinë e akullit, përpiquni të shmangni ngrirjen dhe shkrirjen e përsëritur.
(2) Përdorni gërshërë dhe piskatore të pastra për të prerë një pjesë të vogël të indit, përpiquni të prisni pjesën qendrore të indit kur prisni kampionin, ose fillimisht prisni pjesën e madhe të indit nga mesi dhe më pas prisni kampionin në pozicionin e prerjes së freskët.Indi i hequr duhet të copëtohet plotësisht, të vendoset indi i copëtuar në një tub EP pa RNase, të shtohet lizati, indi i copëtuar duhet të ekspozohet plotësisht ndaj lizatit dhe të përgatitet për homogjenizim.
(3) Për indet normale, zgjidhni indet me madhësi të mungit (30-60 mg) për homogjenizim.Nëse indet përmbajnë një sasi të madhe proteinash, yndyre ose inde të dendura fibroze si mëlçia, rrisni ose ulni në mënyrë të përshtatshme sasinë e indeve të prera (opsionale) Zgjidhni 10~20 mg).
(4) Nëse nxirren muskujt e peshkut, mishi i karkalecave, kandili i detit dhe inde të tjera me përmbajtje të lartë uji, vëllimi i kampionit duhet të rritet në mënyrë të përshtatshme (rekomandohet 100-200 mg).
(5) Nëse kushtet e lejojnë, indi shtazor mund të nxirret drejtpërdrejt pasi të jetë homogjenizuar me një homogjenizues të indeve me kalim të lartë, nëse nuk ka pajisje të tilla.
(6) ARN-ja e përftuar pas nxjerrjes përfundimtare duhet të vendoset menjëherë në kutinë e akullit për të zvogëluar degradimin e ARN-së.
3. Ekstraktimi i ARN-së së qelizave shtazore
(1) Qelizat e suspensionit: centrifugojini direkt dhe hidhni mediumin, lani me PBS steril për 1-2 herë, më pas pezulloni me një sasi të përshtatshme PBS dhe më pas shtoni lizat për lizë.Mos e shtoni lizatin direkt në qelizat e precipituara pasi të keni hedhur plotësisht lëngun.Kjo do të bëjë që paketa e histonit të lëshuar pasi qelizat e lizuara në shtresën e jashtme të ngjiten në pjesën e jashtme të qelizave të precipituara, duke kufizuar kështu kontaktin e qelizave brenda peletit me lizatin., duke rezultuar në lizë jo të plotë të qelizave dhe reduktim të rendimentit të ARN-së.
(2) Qelizat që janë gjysmë ngjitëse ose jo fort: Pas hedhjes së mediumit, lani me PBS për 1-2 herë, më pas thithni drejtpërdrejt një sasi të përshtatshme të PBS dhe fryni enën e kulturës me një pipetë ose pistoletë për të fryrë qelizat dhe transferojini ato në qeliza pa ARN.Shtoni lizatin në tubin EP të enzimës për ekstraktim.
(3) Qelizat ngjitëse: duhet së pari të treten me tripsinë, më pas të mblidhen në tubat EP pa RNase, të centrifugohen për të hequr supernatantin, të lahen 1-2 herë me PBS për të hequr tripsinën e tepërt dhe të risuspendohen me një sasi të përshtatshme PBS Më pas vazhdoni në hapin e ekstraktimit.
4. Ekstraktimi i ARN-së së bimëve
Indet bimore janë të pasura me komponime fenolike, ose të pasura me polisakaride, ose përmbajnë disa metabolitë dytësorë të paidentifikuar, ose kanë aktivitet të lartë të RNase.Këto substanca janë të kombinuara fort me ARN-në pas lizës së qelizave për të formuar komplekse të patretshme ose precipitate koloidale, të cilat janë të vështira për t'u hequr.Prandaj, kur nxjerrim indet bimore, duhet të zgjedhim një çantë për bimët.Lizati në komplet mund të zgjidhë në mënyrë efektive problemet e oksidimit të lehtë të polifenoleve dhe ndarjes së përbërjeve polisakaride dhe acideve nukleike.
(Për ekstraktimin e ARN-së së bimës nga polifenoli polisakarid, produktet e rekomanduara:
(1) Lëvorja, tuli, farat, gjethet etj. të bimës duhet të bluhen plotësisht në llaç.Gjatë procesit të bluarjes, azoti i lëngshëm duhet të plotësohet në kohë për të shmangur shkrirjen e mostrës.Mostra e bluar duhet të shtohet shpejt në lizatë dhe të tundet për të shmangur degradimin e ARN-së.
(2) Për mostrat e pasura me fibra si gjethet e orizit dhe grurit, sasia e nxjerrjes duhet të reduktohet siç duhet, përndryshe bluarja dhe liza e indeve nuk do të jenë të plota, duke rezultuar në një rendiment të ulët të ARN-së së nxjerrë.
(3) Për indet bimore me përmbajtje të lartë uji, si fruti i shegës, fruti i shalqinit, i pjeshkës, etj., madhësia e kampionit duhet të rritet siç duhet (100-200 mg është opsionale).
(4) Indet bimore, të tilla si gjethet e bimëve, rizomat, frutat e forta dhe materialet e tjera përgjithësisht rekomandohen të përdorin azot të lëngshëm për të llaçuar plotësisht përbërësit në një llaç dhe më pas të vazhdohet në hapin e nxjerrjes.Homogjenizuesit e zakonshëm të indeve mund të mos jenë efektivë në homogjenizimin e indeve bimore dhe në përgjithësi nuk rekomandohen.
5. Masat paraprake për nxjerrjen e ARN-së
(1) Mostrat e indeve duhet të jenë sa më të freskëta që të jetë e mundur për të shmangur ngrirjen dhe shkrirjen e përsëritur.
(2) Indi duhet të jetë plotësisht i bluar gjatë nxjerrjes, dhe sasia e indit nuk duhet të jetë shumë e vogël, e lëre më shumë.
(3) Duhet të jepet kohë e mjaftueshme inkubimi pas shtimit të lizatit për të lizuar plotësisht kampionin.
(4) Kur përdorni metodën Trizol për ekstraktim, parimi i thithjes së supernatantit pas shtresimit është "preferoni të thithni më pak se të thithni më shumë", dhe nuk duhet të ekstraktoni në shtresën e mesme, përndryshe do të shkaktojë kontaminim serioz të ADN-së gjenomike.
(5) Gjatë larjes, lëngu larës duhet të depërtojë plotësisht rreth murit të tubit për të siguruar larje të plotë.
(6) Për metodën e nxjerrjes së kolonës, përveç shkëputjes së kolonës pas larjes, kolona e adsorbimit duhet gjithashtu të vendoset në një stol ultra të pastër dhe të fryhet për 5-10 minuta për të avulluar plotësisht tretësin organik deri në tharje.
(7) Në elucionin e fundit të metodës së kolonës, pas shtimit të ujit DEPC, ai duhet të inkubohet për 3-5 minuta, ose uji DEPC duhet të nxehet në 60°C paraprakisht për të rritur rendimentin e elucionit.Në metodën tradicionale të ndarjes së Trizolit dhe precipitimit me izopropanol, ARN-ja përfundimtare shpërndahet në ujin DEPC, kështu që duhet dhënë një kohë e përshtatshme për tretjen dhe fundi i tubit të centrifugës duhet të fryhet vazhdimisht me një majë pipete.
3 Three Shkaqet dhe zgjidhjet për përqendrimin e ulët të ARN-së/cilësinë e dobët
1. Rendimenti është shumë i ulët
Mostra e nxjerrë është shumë e ulët, sasia totale është e pamjaftueshme, ose kampioni i nxjerrë është shumë dhe liza nuk është e plotë;për ekstraktim duhet të përdoren indet ose qelizat e cilësisë së duhur, trajtimi paraprak i kampionit duhet të bëhet mirë dhe liza duhet të jetë e mjaftueshme.
2. Mbetjet e gjenomit
Gjatë nxjerrjes me metodën Trizol, kur supernatanti thithet në shtresën e mesme pas shtresimit, do të shkaktohet kontaminim serioz i gjenomit;duhet pasur kujdes shtesë gjatë shtrimit për të shmangur thithjen në shtresën e mesme.Nëse metoda e kolonës përdoret për ekstraktim, një komplet që përmban DNase I mund të zgjidhet për ekstraktim.Acidi nukleik i absorbuar në membranë tretet drejtpërdrejt me DNazën I, e cila mund të reduktojë shumë mbetjet e ADN-së.
3. Degradimi i ARN-së
Mund të jetë degradimi i vetë kampionit të nxjerrë, ose degradimi i shkaktuar gjatë procesit të nxjerrjes;Për aq sa është e mundur, mostrat e freskëta duhet të përdoren për ekstraktimin e ARN-së dhe mostrat e mbledhura duhet të ruhen në azot të lëngshëm ose në frigorifer -80°C në kohë dhe duhet të shmanget ngrirja dhe shkrirja e përsëritur.Në procesin e nxjerrjes së ARN-së duhet të përdoren majat pa RNase/DNase, tubat e centrifugës dhe materiale të tjera.Procesi i nxjerrjes duhet të jetë sa më i shpejtë.ARN-ja e nxjerrë duhet të vendoset në një kuti akulli dhe të ruhet në -80 në kohë.Nëse ARN-ja e nxjerrë duhet të zbulohet me elektroforezë me xhel, elektroforeza duhet të kryhet menjëherë pas ekstraktimit dhe buferi i elektroforezës duhet të zëvendësohet me një të sapopërgatitur.
4. Mbetjet e kripës dhe tretësve organikë
Reagentët ekstraktues përmbajnë kripëra fenol dhe guanidine, dhe tretësira larës përmban etanol.Gjatë procesit të nxjerrjes, lizati nuk u përthit dhe nuk u hodh plotësisht, dhe tretësira e larjes nuk u tha plotësisht.Kripërat e mbetura dhe tretësit organikë janë të dëmshëm për transkriptimin e kundërt të mëvonshëm dhe PCR.Shkallët e ndryshme të frenimit, kështu që lizati i indeve duhet të hiqet plotësisht gjatë procesit të nxjerrjes, dhe larja duhet të jetë e mjaftueshme në mënyrë që muret rrethuese të tubit të mund të lahen.Përveç kësaj, tubi zbrazet dhe fryhet është një hap i domosdoshëm, i cili do të zvogëlojë më tej mbetjet e lëndës organike.
Për më shumë informacion rreth nxjerrjes së ARN-së, ju lutemi ndiqni faqen tonë të internetit:
www.foreivd.com për më shumë informacion.
Koha e postimit: Dhjetor-01-2022
