Escherichia coli O157:H7 Kit për zbulimin e acidit nukleik (Metoda e sondës fluoreshente PCR)
Përshkrimi i kompletit:
Cat.Nr.FP102
Përdoret për zbulimin dhe ekzaminimin e shpejtë të E. coli O157:H7 në mostrat e ushqimit, ushqimit, ujit dhe mostrave mjedisore.
Përshkrimet
Përdoret për zbulimin dhe ekzaminimin e shpejtë të E. coli O157:H7 në mostrat e ushqimit, ushqimit, ujit dhe mostrave mjedisore.
[Parimi i testimit]Sipas parimit të teknologjisë fluoreshente PCR, primerët specifikë dhe sondat Taqman janë krijuar për gjenin specifik të Escherichia coli O157: H7, dhe zbulohen nga një instrument PCR fluoreshente, në mënyrë që të realizohet zbulimi i Escherichia coli O157: H7 Zbulimi cilësor i ADN-së.
Përmbajtja e kompletit
Shënim: Sonda e kanalit ROX nuk përfshihet.
| Ckomponentët | Specifikim | Quniteti |
| Tampon A | Tub | 1 |
| Buferi B | Tub | 1 |
| Kontroll pozitiv | Tub | 1 |
| Kontroll negativ | Tub | 1 |
Përdorimi i pritshëm
Përdoret për zbulimi dhe ekzaminimi i shpejtë i E. coli O157:H7 në mostrat e ushqimit, ushqimit, ujit dhe mostrave mjedisore.
Kushtet e ruajtjes dhe data e skadimit
Ruani në -20℃ në errësirë dhe shmangni ngrirjen dhe shkrirjen e përsëritur.
Periudha e vlefshmërisë është 12muaj, dhe data e prodhimit tregohet në paketimin e jashtëm.
Instrumentet dhe materialet konsumuese
Instrument PCR sasior fluoreshent, pistoletë me pipetë dhe maja përputhëse, shaker vorteksi, mini centrifugë.
Përdorimi
1. Përpunimi i mostrës
1.1 Lloji i kampionit: Ky komplet është i përshtatshëm për mostrat e ushqimit, ushqimit, ujit dhe mostrave të tjera që dyshohet se janë të kontaminuara nga Escherichia coli O157:H7.Për produktet e mishit të përpunuara thellë, pijet dhe substancat e tjera që përmbajnë pigmente, ato duhet të shpëlahen për të shmangur ndikimin në mbledhjen e sinjalit të fluoreshencës.
1.2 Përpunimi i kampionit: Referojuni "GB 4789.10-2016 Siguria Ushqimore Standardi Kombëtar i Ekzaminimit Mikrobiologjik të Ushqimit të Escherichia coli O157: Testi H7" për përgatitjen e mostrës, kulturën e pasurimit dhe izolimin e Escherichia coli O157: H7.
- Nnxjerrja e acidit ukleik
Merrni 20 mL tretësirë pasurimi në një tub centrifuge 1,5 mL, shtoni 200 μL lizatë mikrobike (kërkohet një komplet shtesë), bëni vorbull për 30 sekonda, centrifugoni shkurtimisht dhe lëreni mënjanë.
Vërejtje: Nxjerrja e acidit nukleik nga lizati duhet të përfundojë brenda 10 minutave dhe nuk mund të ruhet për një kohë të gjatë.
3. Amplifikimi i Acidit Nukleik
3.1 Aktivizoni për përdorim instrumentin sasior PCR fluoreshente.
Bufer A dhe Buffer B nga kompleti, shkrijini ato tërësisht dhe centrifugojini për një kohë të shkurtër.Shtoni 18 μL Bufer A dhe 2 μL Bufer B në secilin tub reagimi PCR.Më pas shtoni 5 ml secilin nga kontrolli negativ, acidi nukleik i nxjerrë dhe kontrolli pozitiv në tubat e reaksionit PCR, mbyllni tubat dhe centrifugoni shkurtimisht.
3.3 Transferoni tubin e reagimit PCR në një makinë PCR fluoreshente dhe përdorni procedurat e mëposhtme për të kryer eksperimente amplifikimi: zgjidhni 25 mL për sistemin e reagimit, mblidhni sinjalet e fluoreshencës në 60°C për çdo cikël dhe zgjidhni FAM për kanalin e zbulimit.
| Hapi | Programi | Numri i cikleve |
| 1 | 37℃ 5 min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60℃ 30s (mbledh fluoreshencë) |
Udhëzues për analizën e problemeve
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Asnjë ARN nuk mund të nxirret ose rendimenti i acidit nukleik është i ulët
Zakonisht ka shumë faktorë që ndikojnë në efikasitetin e rikuperimit, të tilla si: përmbajtja e ARN-së së mostrës, mënyra e funksionimit, vëllimi i elucionit, etj.
Analiza e shkaqeve të zakonshme:
1. Banjë akulli ose centrifugim në temperaturë të ulët (4 ° C) gjatë funksionimit.
Sugjerim: Funksionimi në temperaturën e dhomës (15-25 ° C), asnjëherë banjë akulli dhe centrifugim me temperaturë të ulët.
2. Ruajtja e papërshtatshme e mostrës ose ruajtja e mostrës për një kohë të gjatë.
Sugjerim: Ruani mostrat në -80 ° C ose ngrini në azot të lëngshëm dhe shmangni përdorimin e përsëritur të ngrirjes-shkrirjes;përpiquni të përdorni mostrat e sapo mbledhura për nxjerrjen e ARN-së.
3.Liza e pamjaftueshme e kampionit
Rekomandim: Ju lutemi sigurohuni që kampioni dhe solucioni i punës (Akrilamid linear) të jenë përzier plotësisht dhe të inkubohen për 10 minuta në temperaturën e dhomës (15-25 ° C)
4.Eluenti është shtuar gabimisht
Rekomandim: Sigurohuni që ddH2O pa RNase të shtohet në mes të membranës së kolonës së pastrimit
5.Vëllimi i papërshtatshëm i etanolit anhydrous në Buffer viRW2
Sugjerim: Ju lutemi ndiqni udhëzimet, shtoni vëllimin e duhur të etanolit anhidrik në Buffer viRW2 dhe përziejini mirë përpara se të përdorni kompletin.
6. Përdorimi jo i duhur i mostrës.
Sugjerim: 200µl kampion për 500µl Buffer viRL.Vëllimi i tepërt i mostrës do të rezultojë në uljen e shkallës së nxjerrjes së ARN-së.
7.Vëllimi jo i duhur i elucionit ose elucioni jo i plotë.
Sugjerim: Vëllimi i eluentit të kolonës së pastrimit është 30-50μl;nëse efekti i elucionit nuk është i kënaqshëm, rekomandohet të shtoni ddH pa RNase të ngrohur paraprakisht2O dhe zgjasni kohën e vendosjes në temperaturën e dhomës, si p.sh. 5-10 min
8. Kolona e pastrimit ka mbetje etanoli pas shpëlarjes në Buffer viRW2.
Sugjerim: Nëse etanoli mbetet ende pas shpëlarjes në Buffer viRW2 dhe centrifugimit me tub bosh për 2 minuta, kolona e pastrimit mund të lihet në temperaturën e dhomës për 5 minuta pas centrifugimit në tub bosh për të hequr plotësisht etanolin e mbetur.
Degradimi i molekulave të ARN-së të pastruar
Cilësia e ARN-së së pastruar lidhet me faktorë të tillë si ruajtja e mostrës, ndotja me RNase dhe funksionimi.
Analiza e shkaqeve të zakonshme:
1. Mostrat e mbledhura nuk u ruajtën në kohë.
Sugjerim: Nëse mostra nuk përdoret në kohë pas grumbullimit, ju lutemi ruani menjëherë në -80 ℃ ose azot të lëngshëm.Për nxjerrjen e molekulave të ARN-së, përpiquni të përdorni mostrat e sapombledhura sa herë që është e mundur.
2. Mostrat e mbledhura ngriheshin dhe shkriheshin në mënyrë të përsëritur.
Sugjerim: Shmangni ngrirjen dhe shkrirjen e përsëritur (jo më shumë se një herë) gjatë mbledhjes dhe ruajtjes së mostrës, përndryshe rendimenti i acidit nukleik do të ulet.
3.RNase është futur në sallën e operacionit ose nuk janë mbajtur doreza, maska, etj.
Sugjerim: Eksperimenti i nxjerrjes së molekulave të ARN-së kryhet më së miri në një dhomë të veçantë operacioni të ARN-së dhe tabela eksperimentale pastrohet para eksperimentit.Vishni doreza dhe maska të disponueshme gjatë eksperimentit për të shmangur degradimin e ARN-së të shkaktuar nga futja e RNase.
4. Reagenti kontaminohet nga RNase gjatë përdorimit.
Sugjerim: Zëvendësoni me komplet të ri të izolimit të ARN-së virale për eksperimentet përkatëse.
5. Ndotja me RNase e tubave të centrifugës, majave të pipetave, etj. Sugjerim: Sigurohuni që tubat e centrifugës, majat e pipetave dhe pipetat të jenë të gjitha pa RNase.
Molekulat e pastruara të ARN-së ndikuan në eksperimentet në rrjedhën e poshtme
Molekulat e ARN-së të pastruara nga kolona e pastrimit do të ndikojnë në eksperimentet e rrjedhës së poshtme nëse ka shumë jone kripe ose proteina, të tilla si: transkriptimi i kundërt, Northern Blot, etj.
1. Ka jone kripe të mbetura në molekulat e elutura të ARN-së.
Rekomandim: Sigurohuni që vëllimi i duhur i etanolit anhidrik të jetë shtuar në Buffer viRW2 dhe lani kolonën e pastrimit dy herë sipas shpejtësisë së saktë të centrifugimit në udhëzimet e përdorimit. Nëse ka ende jone kripe të mbetura, mund të shtoni Buffer viRW2 në kolonën e pastrimit dhe ta lini në temperaturën e dhomës për 5 minuta.Më pas kryeni centrifugimin për të hequr në masën më të madhe kontaminimin e joneve të kripës
2. Ka etanol të mbetur në molekulat e ARN-së së elutur
Sugjerim: pasi të konfirmoni që kolonat e pastrimit janë shpëlarë nga Buffer viRW2, kryeni centrifugimin me tub bosh sipas shpejtësisë centrifugale në udhëzimet e përdorimit.Nëse ka mbetur ende etanol, ai mund të lihet për 5 minuta në temperaturën e dhomës pas një centrifugimi me tub bosh për të hequr etanolin e mbetur në masën më të madhe.
Manualet e udhëzimeve:
Manuali i Udhëzimeve të Kompletit të Izolimit të ARN-së virale
