1. Kuptimi fillestar

Në këtë fazë, ne duhet të kuptojmë disa koncepte dhe terminologji, në mënyrë që të mos bëjmë gabime para të moshuarve tanë, si p.sh.

Pyetje: Cili është ndryshimi midis RT-PCR, qPCR, PCR në kohë reale dhe RT-PCR në kohë reale?

Përgjigje: RT-PCR është PCR e transkriptimit të kundërt(PCR me transkriptim të kundërt, RT-PCR), i cili është një variant i përdorur gjerësisht i reaksionit zinxhir polimerazë (PCR).Në RT-PCR, një varg ARN transkriptohet anasjelltas në ADN plotësuese, e cila më pas përdoret si shabllon për amplifikimin e ADN-së me PCR.
PCR dhe qPCR në kohë reale(Quantitative Rea-ltime-PCR) janë e njëjta gjë, të dyja janë PCR sasiore në kohë reale, që do të thotë se çdo cikël i PCR ka regjistrime të të dhënave në kohë reale, kështu që numri i modeleve fillestare mund të rregullohet në analizë të saktë.

Edhe pse si PCR në kohë reale (PCR sasiore fluoreshente në kohë reale) ashtu edhe PCR e transkriptimit të kundërt (PCR e transkriptimit të kundërt) duket se janë shkurtuar si RT-PCR, konventa ndërkombëtare është: RT-PCR në mënyrë specifike i referohet transkriptimit të kundërtPCR, PCR në kohë reale në përgjithësi shkurtohet si qPCR (PCR sasiore në kohë reale).

Dhe RT-PCR në kohë reale (RT-qPCR), është PCR e transkriptimit të kundërt të kombinuar me teknologjinë sasiore fluoreshente: fillimisht merrni cDNA (RT) nga transkriptimi i kundërt i ARN-së dhe më pas përdorni PCR në kohë reale për analizën sasiore (qPCR).Shumica e laboratorëve bëjnë RT-qPCR, domethënë kërkime mbi rregullimin e ulët të shprehjes së ARN-së, kështu që qPCR për të cilën të gjithë flasin në laborator i referohet në fakt RT-qPCR, por mos harroni se ka ende shumë teste të ADN-së në aplikimet klinike.Analiza sasiore, siç është zbulimi i virusit të hepatitit B HBV.

Pyetje: Pasi të keni lexuar shumë PCR sasiore fluoreshente, pse duhet të kontrollohet fragmenti i përforcuar brenda intervalit 80-300 bp?

Përgjigju: Gjatësia e secilës sekuencë gjenike është e ndryshme, disa janë disa kb, disa janë qindra bp, por duhet vetëm të kërkojmë që gjatësia e produktit të jetë 80-300 bp kur dizajnojmë primerë, shumë të shkurtër ose shumë të gjatë nuk janë të përshtatshëm për zbulimin sasior fluoreshent PCR.Fragmenti i produktit është shumë i shkurtër për t'u dalluar nga primer-dimer.Gjatësia e primer-dimerit është rreth 30-40 bp dhe është e vështirë të dallosh nëse është një primer-dimer apo produkt nëse është më pak se 80 bp.Nëse fragmenti i produktit është shumë i gjatë, i kalon 300 bp, ai do të çojë lehtësisht në efikasitet të ulët të amplifikimit dhe nuk mund të zbulojë në mënyrë efektive sasinë e gjenit.

Për shembull, kur numëroni sa njerëz janë në një klasë, ju duhet vetëm të numëroni sa gojë ka.E njëjta gjë është e vërtetë kur zbuloni gjenet, ju duhet vetëm të zbuloni një sekuencë të caktuar të një gjeni për të përfaqësuar të gjithë sekuencën.Nëse doni të numëroni njerëzit, duhet të numëroni gojën dhe hundën, veshët dhe syzet dhe është e lehtë të bëni gabime.

Për t'u zgjeruar, në kërkimin biologjik, ka shumë raste kërkimore nga pika në zonë, sepse sekuenca e gjeneve të çdo specie është shumë e gjatë, është e panevojshme dhe e pamundur të maten të gjitha fragmentet, siç është sekuenca bakteriale 16S, e cila është për të kryer sekuencën konservative të baktereve Analiza për të konstatuar numrin e një popullate të caktuar bakteresh.

Pyetje: Cila është gjatësia optimale për dizajnin e primerit qPCR?

Përgjigju: Në përgjithësi, gjatësia e primerit është rreth 20-24 bp, që është më mirë.Natyrisht, gjatë projektimit të abetares duhet t'i kushtojmë vëmendje vlerës TM të primerit, sepse kjo lidhet me temperaturën optimale të pjekjes.Pas shumë eksperimentesh, është vërtetuar se 60°C është një vlerë më e mirë TM.Nëse temperatura e pjekjes është shumë e ulët, ajo lehtë do të çojë në përforcim jo specifik.Nëse temperatura e pjekjes është shumë e lartë, efikasiteti i amplifikimit do të jetë relativisht i ulët, kulmi i kurbës së amplifikimit do të fillojë më vonë dhe vlera e CT do të vonohet.

Pyetje: Si ndryshon metoda e ngjyrosjes nga metoda e sondës?

Përgjigje: Metoda e ngjyrosjesDisa ngjyra fluoreshente, të tilla si SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, etj., nuk emetojnë vetë dritën, por do të lëshojnë fluoreshencë pasi të lidhen në brazdë të vogël të ADN-së me dy fije.Prandaj, në fillim të reaksionit PCR, makina nuk mund të zbulojë sinjalin fluoreshent.Kur reaksioni arrin në fazën e pjekjes-zgjatjes, vargu i dyfishtë hapet dhe një varg i ri sintetizohet nën veprimin e polimerazës së ADN-së dhe molekula fluoreshente lidhet me brazdë të vogël dsDNA.Me rritjen e numrit të cikleve PCR, gjithnjë e më shumë ngjyra kombinohen me ADN me dy fije, dhe sinjali fluoreshent gjithashtu përmirësohet vazhdimisht.Metoda e ngjyrosjes përdoret kryesisht në kërkimin shkencor.
PS: Kini kujdes kur bëni eksperimentin, boja duhet të kombinohet me ADN-në e njeriut, kujdes ta ktheni atë në një person fluoreshente.

Metoda e ngjyrosjes (majtas) Metoda e sondës (djathtas)
PS: Kini kujdes kur bëni eksperimentin, boja duhet të kombinohet me ADN-në e njeriut, kujdes ta ktheni atë në një person fluoreshente.

SYBR E gjelbër Ⅰ lidhet me brazdë të vogël të ADN-së

Metoda e sondësSonda Taqman është sonda më e përdorur e hidrolizës.Ekziston një grup fluoreshent në fundin 5' të sondës, zakonisht FAM, dhe vetë sonda është një sekuencë plotësuese e gjenit të synuar.Ekziston një grup shuarjeje fluoreshente në fundin 3′.Sipas parimit të transferimit të energjisë së rezonancës fluoreshente (transferimi i energjisë së rezonancës Förster, FRET), kur grupi fluoreshent raportues (molekula fluoreshente dhuruese) dhe grupi fluoreshente shuarës (molekula fluoreshente pranuese) ngacmohen Kur spektri mbivendoset dhe distanca e pakësimit të 710 është shumë. fluoreshenca e molekulës pranuese, ndërsa autofluoreshenca dobësohet.Prandaj, në fillim të reaksionit PCR, kur sonda është e lirë dhe e paprekur në sistem, grupi fluoreshent raportues nuk do të lëshojë fluoreshencë.Gjatë pjekjes, primeri dhe sonda lidhen me shabllonin.Gjatë fazës së shtrirjes, polimeraza sintetizon vazhdimisht zinxhirë të rinj.ADN polimeraza ka aktivitet ekzonukleazë 5'-3'.Kur të arrijë në sondë, polimeraza e ADN-së do të hidrolizojë sondën nga shablloni, do të ndajë grupin fluoreshent raportues nga grupi fluoreshent shues dhe do të lëshojë sinjalin fluoreshent.Meqenëse ekziston një marrëdhënie një-për-një midis sondës dhe shabllonit, metoda e sondës është më e lartë se metoda e ngjyrosjes për sa i përket saktësisë dhe ndjeshmërisë së provës.Metoda e sondës përdoret kryesisht në diagnostikim.

Pyetje: Çfarë është kuantifikimi absolut?Çfarë është kuantifikimi relativ?

Përgjigju: Kuantifikimi absolut i referohet llogaritjes së numrit fillestar të kopjes së mostrës që do të testohet me qPCR, si p.sh. sa viruse HBV ka në 1 ml gjak.Rezultati i marrë nga kuantifikimi relativ është ndryshimi në sasinë e gjenit të synuar në një kampion specifik në lidhje me një kampion tjetër referencë, dhe shprehja e gjenit është e rregulluar lart ose poshtë.

Pyetje: A do të ndikojnë në rezultatet eksperimentale sasia e nxjerrjes së ARN-së, efikasiteti i transkriptimit të kundërt dhe efikasiteti i amplifikimit?
Pyetje: A do të ndikojnë në rezultatet eksperimentale ruajtja e mostrës, reagentët e nxjerrjes, reagentët e transkriptimit të kundërt dhe materialet harxhuese që transmetojnë dritë?
Pyetje: Cila metodë mund të korrigjojë të dhënat eksperimentale?

Lidhur me këto çështje, ne do t'i përshkruajmë ato në detaje në seksionet e avancuara dhe të avancuara më poshtë.
2. Njohuri të avancuara

Në lidhje me PCR sasiore fluoreshente në kohë reale, duhet të pranojmë realitetin që mijëra punime kërkimore shkencore publikohen çdo vit, ndër të cilat teknologjia sasiore fluoreshente PCR nuk është një numër i vogël.

Nëse nuk ka standard të përbashkët për të matur eksperimentin sasior PCR fluoreshente, rezultatet mund të ndryshojnë shumë.Për të njëjtin gjen të së njëjtës specie, me të njëjtën metodë përpunimi, rezultatet e zbulimit do të ndryshojnë gjithashtu shumë dhe do të jetë e vështirë për të ardhurit e vonë të përsërisin të njëjtat rezultate.Ju Askush nuk e di se cila është e drejtë dhe cila është e gabuar.

A do të thotë kjo se PCR sasiore fluoreshente është një teknologji mashtrimi apo një teknologji jo e besueshme?Jo, sepse PCR sasiore fluoreshente është më e ndjeshme dhe më e saktë, dhe një operacion pak i gabuar do të sjellë rezultate krejtësisht të kundërta.Një humbje e vogël është një mijë milje larg.Autori i artikullit mund të torturohet në mënyrë të përsëritur nga recensuesit.Në të njëjtën kohë, recensuesit e revistës janë gjithashtu të vështirë për t'u zgjedhur nga rezultate të ndryshme eksperimentale.

Në përgjithësi, duke treguar mungesën e konsensusit në eksperimentet PCR në kohë reale.Për këtë qëllim, shkencëtarët e vjetër në industri filluan të formulojnë standarde,duke kërkuar nga kontribuesit të japin disa detaje të nevojshme eksperimentale dhe të përpunimit të të dhënave (përfshirë të dhënat e nevojshme) në artikull për të përmbushur këto standarde.

Rishikuesit mund të gjykojnë cilësinë e eksperimentit duke lexuar këto detaje;Lexuesit e ardhshëm mund ta përdorin gjithashtu këtë për të përsëritur eksperimentin ose për të përmirësuar eksperimentin.Pastaj rezultatet eksperimentale të marra në këtë mënyrë janë plot informacione, cilësore dhe të përdorshme.

MIBBI (Informacioni Minimal për Hetimet Biologjike dhe Biomjekësore -http://www.mibbi.org) erdhi në ekzistencë.MIBBI është një projekt që ofron standarde për eksperimente.Është botuar në natyrë.Ky projekt synon eksperimente të ndryshme biologjike, duke përfshirë biologjinë qelizore, Microarray, qPCR që do të diskutojmë tani, etj., dhe parashikon çdo lloj eksperimenti kur dorëzoni dorëshkrime.Ky informacion duhet të jepet në çdo kohë.

Në projektin MIBBI, ka dy artikuj që lidhen me PCR sasiore fluoreshente, domethënë:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – një gjuhë e strukturuar dhe udhëzues raportimi për të dhënat sasiore PCR në kohë reale;
·MIQE (Informacion minimal për publikimin e eksperimenteve sasiore të PCR në kohë reale) – informacion minimal për botimin e artikujve rreth eksperimenteve sasiore PCR në kohë reale.
Së pari, le të flasim për RDML, specifikimin e terminologjisë.

Nëse nuk ka përkufizim standard për gjithçka, është e pamundur të vazhdohet diskutimi, prandaj shpjegimi i termave është kaq i rëndësishëm në provim.
Terminologjia e përdorur në eksperimentin sasior PCR fluoreshente përfshin përmbajtjen e mëposhtme.QIAGEN ka bërë përmbledhjen më të mirë për ne.Më poshtë janë të gjitha të thatamallrave .

Kurba e amplifikimit
Kurba e amplifikimit i referohet lakores së bërë gjatë procesit PCR, me numrin e ciklit si abshisë dhe intensitetin e fluoreshencës në kohë reale gjatë reaksionit si ordinatë.

Një kurbë e shkëlqyer amplifikimi duhet të ketë karakteristikat e mëposhtme: vija bazë është e sheshtë ose pak e ulur dhe nuk ka tendencë të dukshme rritëse;pika e lakimit të kurbës është e qartë dhe pjerrësia e fazës eksponenciale është në përpjesëtim me efikasitetin e amplifikimit.Sa më i madh të jetë pjerrësia, aq më i lartë është efikasiteti i amplifikimit;kurba e përgjithshme e amplifikimit Paralelizmi është i mirë, duke treguar se efikasiteti i amplifikimit të çdo tubi është i ngjashëm;faza eksponenciale e lakores së amplifikimit të mostrave me përqendrim të ulët është e dukshme.

Vija bazë (Bazë)
Niveli bazë është niveli i zhurmës së ciklit të hershëm, zakonisht matet midis ciklit të 3-të dhe 15-të, sepse rritja e vlerës së fluoreshencës e shkaktuar nga produkti i amplifikimit nuk mund të zbulohet gjatë kësaj periudhe.Numri i cikleve të përdorura për të llogaritur bazën mund të ndryshojë dhe mund të duhet të reduktohet nëse përdoren sasi të larta modeli ose nëse niveli i shprehjes së gjenit të synuar është i lartë.

Vendosja e vijës bazë kërkon shikimin e të dhënave të fluoreshencës nga kurba e amplifikimit të linearitetit.Vija bazë është vendosur në mënyrë që rritja e kurbës së amplifikimit të fillojë me një numër cikli më të madh se numri kryesor i ciklit bazë.Linjat bazë duhet të vendosen individualisht për çdo sekuencë të synuar.Vlerat mesatare të fluoreshencës të zbuluara në ciklet e hershme duhet të zbriten nga vlerat e fluoreshencës të marra në produktet e përforcuara.Versionet më të fundit të softuerëve të ndryshëm PCR në kohë reale lejojnë optimizimin automatik të cilësimeve bazë për mostrat individuale.

Gjatë cikleve të para të reaksionit të amplifikimit PCR, sinjali i fluoreshencës nuk ndryshon shumë.Afrimi i një vije të drejtë quhet vija bazë, por nëse shikojmë nga afër ciklet e para, shohim se brenda vijës bazë është ajo që po ndodh në foton më poshtë.

Sfondi Sfondi i referohet
vlera jo specifike e fluoreshencës në reaksion.Për shembull: shuarje joefikase fluoreshence;ose një numër i madh i shablloneve të ADN-së me dy zinxhirë për shkak të përdorimit të SYBR Green.Komponentët e sfondit të sinjalit hiqen matematikisht nga algoritmi i softuerit PCR në kohë reale.

Sinjali i reporterit
Sinjali i raportuesit i referohet sinjalit fluoreshent të gjeneruar nga sondat SYBR Green ose të etiketuara fluoreshente për sekuencë specifike gjatë PCR në kohë reale.

Sinjali i raportuesit të normalizuar (RN)
RN i referohet intensitetit të fluoreshencës së bojës raportuese të ndarë me intensitetin e fluoreshencës së ngjyrës referuese pasive të matur në çdo cikël.

Bojë me referencë pasive
Në disa PCR në kohë reale,ngjyra fluoreshente ROX përdoret si një referencë e brendshme për të normalizuar sinjalin fluoreshent.Ai korrigjon ndryshimet për shkak të tubimit të pasaktë, pozicionit të pusit dhe luhatjeve të fluoreshencës në bazë të pusit.

Pragu i fluoreshencës (pragu)
u rregullua mbi vlerën e sfondit dhe dukshëm nën vlerën e pllajës së lakores së amplifikimit.Duhet të shtrihet në rajonin linear të kurbës së amplifikimit, duke përfaqësuar diapazonin log-linear të zbulimit të PCR.Pragjet duhet të vendosen në pamjen e kurbës së amplifikimit log në mënyrë që faza log-lineare e PCR të jetë lehtësisht e identifikueshme.Nëse ka shumë gjene të synuar në PCR në kohë reale, pragu duhet të vendoset për çdo objektiv.Në përgjithësi, sinjali i fluoreshencës i 15 cikleve të para të reaksionit PCR përdoret si sinjal i sfondit të fluoreshencës, dhe pragu i fluoreshencës është 10 herë më i madh se devijimi standard i sinjalit të fluoreshencës të 3 deri në 15 cikleve të para të PCR, dhe faza e fluoreshencës është vendosur në eksplorim të PCR.Në përgjithësi, çdo instrument ka pragun e tij të fluoreshencës të vendosur përpara përdorimit.

Pragu i ciklit (CT) ose Pika e Kalimit (CP)
Cikli në të cilin kurba e amplifikimit kalon pragun (dmth, pika në të cilën zbulimi i fluoreshencës rritet ndjeshëm).CT mund të jetë një fraksion dhe sasia e shabllonit fillestar mund të llogaritet.Vlera CT përfaqëson numrin e cikleve të përjetuara kur sinjali fluoreshent në çdo tub reagimi PCR arrin pragun e caktuar.Ekziston një lidhje lineare midis vlerës CT të secilit shabllon dhe logaritmit të numrit fillestar të kopjes së shabllonit,sa më i lartë numri fillestar i kopjes, aq më i vogël është vlera e CT dhe anasjelltas.Një kurbë standarde mund të bëhet duke përdorur një standard me numër të njohur të kopjes fillestare, ku abshisa përfaqëson vlerën CT dhe ordinata përfaqëson logaritmin e numrit fillestar të kopjes.Prandaj, për sa kohë që merret vlera CT e kampionit të panjohur, numri fillestar i kopjes së mostrës mund të llogaritet nga kurba standarde.

Vlera ΔCT
Vlera ΔCT përshkruanndryshimi midis gjenit të synuar dhe vlerës përkatëse të CT të gjenit referencë endogjen, të tilla si një gjen shtëpiak, dhe përdoret për të normalizuar sasinë e shabllonit të përdorur:
⇒ΔCT = CT (gjeni i synuar) – CT (gjen referencë endogjen)

Vlera ΔΔCT
Vlera ΔΔCT përshkruan ndryshimin midis vlerës mesatare ΔΔCT të një kampioni me interes (p.sh. qelizat e stimuluara) dhe vlerës mesatare ΔΔCT të një kampioni referencë (p.sh. qelizat e pastimuluara).Mostra e referencës quhet gjithashtu kampioni i kalibrimit dhe të gjitha mostrat e tjera normalizohen në këtë për kuantifikimin relativ:
⇒ΔΔCT = ΔCT mesatare (mostra me interes) – ΔCT mesatare (mostra referente)

Gjenet referuese endogjene (gjenet referente endogjene)
Nivelet e shprehjes së gjeneve referente endogjene, të tilla si gjenet e shtëpisë (gjenet e shtëpisë), nuk ndryshojnë midis mostrave.Krahasimi i vlerave të CT të gjenit të referencës me gjenin e synuar lejon që niveli i shprehjes së gjenit të synuar të normalizohet në sasinë e ARN-së ose cDNA-së hyrëse (shih seksionin mbi vlerat ΔCT më lart).

Gjenet e brendshme të referencës janë të sakta përdegradimi i mundshëm i ARN-së ose prania e frenuesve të enzimës në mostrat e ARN-së, si dhe variacionet në përmbajtjen e ARN-së, efikasiteti i transkriptimit të kundërt, rikuperimi i acidit nukleik dhe trajtimi i mostrës.Për të zgjedhur gjenin/gjenet e referencës optimale, ne modifikuam algoritmin për të lejuar zgjedhjen e referencës optimale në varësi të cilësimeve eksperimentale.

Kontrolli i brendshëm
Një sekuencë kontrolli që përforcohet në të njëjtin reaksion me sekuencën e synuar dhe hetohet me një sondë të ndryshme (dmth. duke kryer PCR dupleks).Kontrollet e brendshme shpesh përdoren për të përjashtuar amplifikimit e dështuar, si për shembull kur sekuenca e synuar nuk zbulohet.
Mostra e kalibrimit
Një mostër referencë (për shembull, ARN e pastruar nga një linjë qelizore ose inde) e përdorur në sasinë relative për të krahasuar të gjitha mostrat e tjera për të përcaktuar nivelin relativ të shprehjes së një gjeni.Mostra e kalibrimit mund të jetë çdo mostër, por zakonisht është një kontroll (për shembull, një mostër e patrajtuar ose një mostër nga koha zero e eksperimentit).

Kontrollet pozitive
përdorin reaksionet e kontrollit mesasitë e njohura të shabllonit.Kontrollet pozitive përdoren shpesh për të kontrolluar nëse grupi i primerit ose grupi i sondës së primerit po funksionon siç duhet dhe nëse reaksioni është konfiguruar saktë.

Pa kontroll shabllon (NTC)
Një reaksion kontrolli që përmban të gjithë përbërësit e nevojshëm të reaksionit të amplifikimit përveç shabllonit, i cili zakonisht zëvendësohet me ujë.Përdorimi i NTC mund të gjejë ndotjen e shkaktuar nga kontaminimi me reagent ose ADN-ja e huaj, duke siguruar kështu vërtetësinë dhe besueshmërinë e të dhënave të zbulimit.Përforcimi i kontrollit NTC tregon kontaminim.

Nuk ka kontroll RT (NRT)
Procesi i nxjerrjes së ARN-së mund të përmbajë ADN gjenomike të mbetur, e cila është jashtëzakonisht e dëmshme dhe është fajtori që ndikon në cilësinë e të dhënave dhe armiku natyror i qPCR, kështu që gjatë projektimit të eksperimenteve, ai duhet të projektohet vetëm për të përforcuar zbulimin e ARN-së.Ka dy mënyra, njëra është të dizenjoni abetare nëpër introne, tjetra është të hiqni plotësisht ADN-në, cila është më e mirë, e cila do të diskutohet më vonë.Kontrolli NTR është një pasqyrë magjike për të zbuluar ndotjen e ADN-së.Nëse ka përforcim, do të thotë se ka ndotje.

Standardet
Standardet janë mostra të përqendrimit të njohur ose numrit të kopjeve që përdoren për të ndërtuar një kurbë standarde.Për të siguruar stabilitetin e standardit, fragmenti i gjenit zakonisht klonohet në plazmid dhe përdoret si standard.

Kurba standarde
zakonisht hollohet në të paktën 5 gradient përqendrimi me produktin standard sipas raportit të dyfishimit, dhe 5 pika vizatohen në koordinatat e vlerës CT dhe numrit të kopjes, dhe pikat lidhen për të formuar një vijë për të gjeneruar një kurbë standarde.Për çdo kurbë standarde, vlefshmëria e saj duhet të kontrollohet.Vlera e pjerrësisë bie ndërmjet –3.3 dhe –3.8, dhe çdo përqendrim kryhet në tre kopje.Pikat që janë dukshëm të ndryshme nga pikat e tjera duhet të hidhen poshtë.Vlera CT e kampionit që do të testohet sillet në kurbën standarde dhe mund të llogaritet niveli i shprehjes së kampionit që do të testohet.

Vlera CT e kampionit që do të testohet sillet në lakoren standarde dhe mund të llogaritet numri fillestar i kopjes së kampionit që do të testohet.

Efikasiteti dhe pjerrësia
Pjerrësia e kurbës standarde përfaqëson efikasitetin e PCR në kohë reale.
·Një pjerrësi prej -3,322 tregon se efikasiteti i amplifikimit të PCR është 1, ose 100% efikas, dhe sasia e produktit PCR dyfishohet në çdo cikël.
· Një pjerrësi më e vogël se –3,322 (p.sh., –3,8) tregon një efikasitet PCR
·Një pjerrësi më e madhe se –3.322 (p.sh. –3.0) tregon se efikasiteti i PCR duket të jetë më i madh se 100%, gjë që është kurioze, si mund të gjenerojë një cikël PCR më shumë se dyfishi i produktit të përforcuar?Kjo situatë ndodh në fazën jolineare të reaksionit PCR, domethënë ka një sasi të madhe të amplifikimit jo specifik.

kurba e shkrirjes
Pasi të përfundojë amplifikimi qPCR, produkti PCR nxehet.Me rritjen e temperaturës, produkti i amplifikimit me dy fije shkrihet gradualisht, duke rezultuar në një ulje të intensitetit të fluoreshencës.Kur arrihet një temperaturë e caktuar (Tm), një numër i madh produktesh do të shkrihen.Fluoreshenca bie ndjeshëm.Produkte të ndryshme PCR kanë vlera të ndryshme Tm dhe temperatura të ndryshme shkrirjeje, në mënyrë që të mund të identifikohet specifika e PCR.

Kurba e shkrirjes (kurba e derivatit)
Kurba e shkrirjes rrjedh për të formuar një hartë kulmore, e cila mund të shfaqë në mënyrë më intuitive situatën e fragmenteve të produktit PCR.Meqenëse temperatura e shkrirjes është vlera Tm e fragmentit të ADN-së, mund të gjykohen disa parametra që ndikojnë në vlerën Tm të fragmentit të ADN-së, të tilla si madhësia e fragmentit, përmbajtja GC, etj. Në përgjithësi, sipas parimeve tona të projektimit të primerit,gjatësia e produktit të përforcuar është në intervalin 80-300 bp, kështu që temperatura e shkrirjes duhet të jetë ndërmjet 80°C dhe 90°C.

Interpretimi i kurbës së shkrirjes: Nëse e vetmja pikë kryesore kryesore shfaqet ndërmjet 80°C-90°C, kjo do të thotë se PCR sasiore fluoreshente është e përsosur;nëse kulmi kryesor shfaqet ndërmjet 80°C-90°C dhe maja të ndryshme shfaqen nën 80°C, dimeri i primerit në thelb merret parasysh.Mund të përpiqeni të rrisni temperaturën e pjekjes për ta zgjidhur atë;nëse kulmi kryesor shfaqet ndërmjet 80°C-90°C, dhe kulmi i ndryshëm shfaqet sërish kur rritet temperatura, në thelb konsiderohet se ka kontaminim të ADN-së dhe ADN-ja duhet të hiqet në fazën fillestare të eksperimentit.

Sigurisht që ka ende disa situata jonormale, të cilat do t'i zbërthejmë një nga një më poshtë.
3. Njohuri të avancuara

Për të bërë qPCR, duhet të them MIQE,Informacioni minimalpër Publikimin eSasiorePCR në kohë realeEksperimentet - informacioni minimal për botimin e artikujve në lidhje me PCR sasiore në kohë realeeksperimente.Për të thjeshtuar të kuptuarit e të gjithëve, ne do të thjeshtojmë përmbajtjen kryesore.

Tekstin origjinal të MIQE-së mund ta kërkoni në internet dhe më e rëndësishmja është se ai përcaktonlista kontrolluese e të dhënave që duhet të sigurohen gjatë publikimit të një artikulli .

Rishikuesit mund të gjykojnë cilësinë e eksperimentit duke lexuar këto detaje;Lexuesit e ardhshëm mund ta përdorin gjithashtu këtë për të përsëritur ose përmirësuar eksperimentin.
Vlen të theksohet se në këtë listë rëndësia e secilës listë shënohet përkatësisht me E ose D.Çfarë do të thotë?E: informacion thelbësor (duhet të dorëzohet);D: informacion i dëshirueshëm (siguro sa më shumë që të jetë e mundur).

MIQE (1)-Dizajn eksperimental
Shumë të poshtër që kanë përfunduar mbrojtjen e tyre pas mbarimit të studimeve pasuniversitare nuk do të dinë të hartojnë një eksperiment në mënyrë të pavarur, të hapin fletoret e tyre dhe të bëjnë atë që mësuesi u thotë të bëjnë.Si rezultat, dizajni eksperimental nuk ishte rigoroz dhe redaksia e revistës tha se ata donin të krijonin këtë foto dhe atë foto, kështu që ata e bënë atë me habi.Keshtu behen piskat!

Më afër shtëpisë, parimi i parë i eksperimentit është përcaktimiashpërsia e logjikës eksperimentale.Gjëja më themelore është dizajni eksperimental, dhe gjëja më e rëndësishme në lidhje me dizajnin eksperimental është se si të vendoset kampioni i synuar, mostra e referencës (kontrolli) dhe numri i përsëritjeve, në mënyrë që të dhënat eksperimentale të mund të referohen, të krahasohen dhe bindëse.

Mostra e synuari referohet kampionit që kërkon që ne të zbulojmë gjenin e synuar pas një trajtimi të caktuar.Mostra e referencësështë kampioni pa asnjë trajtim, i cili shpesh përmendet si tip i egër në biologji.

Përsëritje eksperimentalejanë shumë të rëndësishme.Në përgjithësi, numri i përsëritjeve bindëse duhet të jetë më shumë se tre.Është e nevojshme të dallohet se çfarë është replikimi biologjik dhe çfarë është replikimi teknik.

Replikat biologjike: I njëjti eksperiment verifikimi i bërë me materiale të ndryshme (kohë, bimë, tufa, pllaka reaksioni).

Dyfishimi biologjik
Le të marrim si shembull trajtimin me pesticide të specit.Ne duam të spërkasim pesticide në tre bimët e ABC, pastaj tre bimët e ABC janë tre replikatë biologjike dhe janë i njëjti eksperiment verifikimi i kryer me materiale të ndryshme.Por si eksperiment, duhet patjetër një kontroll, ndaj mund të spërkasim një nga degët e bimës A për të formuar një grup eksperimental të bimës A dhe jo të spërkasim degët e tjera të bimës A për të formuar një grup kontrolli.Bëni të njëjtën gjë për B dhe C.

Replikat teknike (Replikat teknike): Është një eksperiment i përsëritur i krijuar për të shmangur gabimet e shkaktuara nga operimi, i cili në fakt është një vrimë e kopjuar e përfshirë në të njëjtin material.Të dy trajtimet dhe kontrollet duhet të kenë cilësime të përsëritura (minimumi tre) të gjenit të synuar dhe gjenit të brendshëm të referencës.

Përsëritje teknike
Merrni sërish si shembull specin e trajtuar me pesticide.Për grupin eksperimental të bimës A, ne bëmë tre vrima PCR me 1, 2 dhe 3 përkatësisht për gjenin e tij të synuar dhe gjenin e brendshëm referencë, në mënyrë që të merret mesatarja pas zbulimit.Për kontrollin e impiantit A Grupet trajtohen gjithashtu në të njëjtën mënyrë.Në mënyrë të ngjashme, bëni të njëjtin trajtim për bimët B dhe C.Kjo është përsëritje teknike.

Vlen të theksohet seajo që hyn në statistikë është përsëritja biologjike, dhe përsëritja teknike është për të testuar nëse ka ndonjë dukuri të rastësishme në procesin eksperimental, në mënyrë që rezultatet eksperimentale të bëhen të besueshme, domethënë të shmangen gabimet duke marrë mesataren e tyre siç themi shpesh.

Kontrollet negative-NTC dhe NRT
NTC (Kontrolli pa shabllon), një kontroll pa shabllon, përdoret për të verifikuar nëse materiali eksperimental është i kontaminuar.Në përgjithësi, uji përdoret si shabllon.Nëse ka një reaksion fluoreshent, kjo tregon se ndotja me acid nukleik ka ndodhur në laborator.

Këto ndotje vijnë nga: uji i papastër, reagentët e pakualifikuar që përmbajnë ADN endogjene, ndotja me primer, ndotja e pajisjeve laboratorike, ndotja me aerosol etj., duhet të përdoren pastruesit e RNase dhe frenuesit RNase.Ndotja me aerosol është më e vështira për t'u gjetur.Imagjinoni që laboratori juaj është si smogu, me acide të ndryshme nukleike të pezulluara në ajër.

NRT (Transkriptazë Jo-Reverse), kontrolli pa transkriptim të kundërt, është ARN e transkriptuar jo e kundërt si kontroll negativ, që është kontrolli i mbetjes së gADN-së.

Kur bëhet shprehja e gjeneve, sasia e ARN-së zbulohet duke zbuluar sasinë e cDNA pas transkriptimit të kundërt.Nëse ka mbetje të gADN-së kur ARN pastrohet, kjo do të shkaktojë gabime në rezultatet eksperimentale, sepse rezultatet aktuale të marra janë gDNA dhe cDNA.Në nivelin agregat, jo vetëm cDNA, gDNA duhet të hiqet plotësisht gjatë nxjerrjes së ARN-së.

MIQE (2) - mostër e informacionit
I ashtuquajturi informacion mostër do të thotë që kur publikojmë një artikull rreth qPCR, duhet të shpjegojmë qartë informacionin e mostrës, i cili është një pjesë e domosdoshme e artikullit.Në mënyrë të ngjashme, kur përpunojmë mostrat, duhet të rregullojmë edhe operacionet tona për të siguruar vlefshmërinë e mostrave.

Përshkrimi i kampionit është vetëm një rezultat, dhe ne duhet t'i kushtojmë më shumë vëmendje materialeve të marra gjatë gjithë eksperimentit.

Përzgjedhja e materialeve eksperimentale
Mostrat e gjakut – zgjidhni gjak të freskët, jo më shumë se 4 orë.Mostrat e qelizave – zgjidhni të grumbulloni qeliza të freskëta në një periudhë rritjeje të fuqishme.Indet e kafshëve—Zgjidhni inde të freskëta, me rritje të fuqishme.Indi bimor - Zgjidhni inde të freskëta dhe të reja.

Duhet ta keni vënë re se ka një fjalë kyçe në këto pak fjali: i freskët .
Për mostrat e mësipërme, kompleti më i mirë, me kosto efektive dhe i qëndrueshëm në treg është kompleti i Foregene, i cili mund të nxjerrë shpejt dhe me lehtësi ADN-në dhe ARN-në e tyre.

Mini Kit i ADN-së së gjakut

Kompleti i izolimit të ARN-së totale të qelizave

Kompleti i izolimit total të ARN-së së Kafshëve

Kompleti i izolimit të ARN-së totale të bimëve

Kompleti i izolimit total të ARN-së së bimëve Plus

Kompleti i izolimit të ADN-së së bimëve

Ruajtja e materialeve eksperimentale
Në përgjithësi, ne nuk rekomandojmë ruajtjen e mostrave, nëse kushtet e lejojnë.Megjithatë, ka shumë miq që nuk mund të kryejnë eksperimente menjëherë pas marrjes së mostrave, dhe disa madje duhet të mbajnë rezervuarë me azot të lëngshëm në fushë për marrjen e mostrave.

Për këtë lloj shoku punëtor, mund të them vetëm se ju nuk i kuptoni harxhimet e reagentëve.Tani shumë kompani konsumuese të reagentëve prodhojnë reagentë që mund të ruajnë mostrat e ARN-së në temperaturën e dhomës dhe ju mund të zgjidhni t'i përdorni ato.Metoda konvencionale e ruajtjes është ruajtja e azotit të lëngshëm, duke përdorur një rezervuar të vogël të azotit të lëngshëm që është i lehtë për t'u mbajtur.Pas kthimit të kampionit në laborator, ruajeni në frigorifer -80°C.

Për eksperimentet që përfshijnë ARN, duhet të ndiqet parimi me gjashtë fjalë:temperatura e ulët, pa enzima,dheshpejtë .

Koncepti i temperaturës së ulët është i lehtë për t'u kuptuar;pa enzima, RNase është kudo në botën ku jetojmë (përndryshe do të kishit vrarë nga HIV), kështu që si të shmangni RNase kur bëni eksperimente është një koncept shumë i rëndësishëm;shpejt,Nuk ka Kung Fu në botë që nuk mund të thyhet, vetëm shpejtësia nuk mund të prishet.

Prandaj, në një farë kuptimi, sa më e shkurtër të jetë koha e nxjerrjes, aq më i mirë është kompleti.Pse bënForegeneKit theksojnë shpejtësinë, sepse ata e dinë mirë atë.

PS: Disa vajza bëjnë eksperimente me shumë kujdes, por nuk janë aq të mira sa një slam dunk pas disa vitesh punë.Ata mendojnë se Perëndia është i padrejtë, ankohet për të tjerët dhe kërkon jetën.Në fakt, ajo nuk e kuptoi.Ai nuk e mbrojti mirë ARN-në dhe lojtari i slam dunk ishte i shkathët.Kur po bënte eksperimentin, mendoi se do ta përfundonte slam dunk me tre herë, pesë herë dhe dy ndarje, por eksperimentin e bëri mirë.

shënim: Më i ngadalshëm, më shumë shanse për pushtimin e RNase.Si ta stërvitni veten për të qenë të shpejtë?Nuk ka asnjë mënyrë, thjesht praktikoni më shumë.

Për eksperimente të ndryshme dhe mostra të ndryshme, është ende e nevojshme të lexoni më shumë literaturë dhe të zgjidhni një metodë të përshtatshme për përpunim.Për procesin e mbledhjes dhe ruajtjes së mostrës, MIQE kërkon që ai duhet të shkruhet qartë në letër, në mënyrë që recensuesit të mund të rishikojnë besueshmërinë e punimit dhe është gjithashtu e përshtatshme për të rinjtë e habitur të përsërisin eksperimentin tuaj.

Megjithëse eksperimentet biologjike janë të vështira, ato janë të nivelit të lartë.Nëse nuk jeni të kujdesshëm, mund ta përmbysni botën.Për shembull, duke e shndërruar SARS-in në një krizë biokimike, ose duke bërë oriz hibrid për të shpëtuar 1.3 miliardë njerëz.Fotografia më poshtë është një eksperiment kimik, ju duhet të kuptoni se sa krenare jeni për kërkimin tuaj vetëm duke parë pamjen e tij si kar.Harroje, mos e nxi.

MIQE (3) – nxjerrja e acidit nukleik.
Nxjerrja e acidit nukleik është një ngjarje e madhe dhe të gjitha eksperimentet e biologjisë molekulare fillojnë me nxjerrjen e acidit nukleik.Para së gjithash, le të kopjojmë përmbajtjen e MIQE në nxjerrjen e acidit nukleik.

Duke parë këtë formë, nuk mund të qëndroni në sipërfaqe.Forma është një dogmë.Për të qenë një student i mirë, duhet të pyesni pse.Përmbajtja thelbësore e kësaj tabele është: Ndjekpastërtinë, integritetin, konsistencën dhe sasinë e nxjerrjes së ARN-së .

Pjesa e parë eprocesi ose instrumenti është hapi i nxjerrjes së acidit nukleik.Nëse përdorni një ekstraktues automatik të acidit nukleik për të nxjerrë (i avancuar, ju lutem më kontaktoni për blerje), duhet të tregoni emrin e modelit të instrumentit.

Emri i kompletit dhe

çfarë komplete është përdorur për detajet e ndryshimit, çfarë reagentësh specialë janë shtuar ose çfarë operacionesh speciale janë bërë duhet të shpjegohet qartë në mënyrë që të tjerët të mund ta përsërisin me lehtësi eksperimentin tuaj.

Disa njerëz shtojnë disa reagentë të veçantë kur nxjerrin mostra të veçanta, duke menduar se kjo është arma e tyre sekrete dhe nuk ua thonë të tjerëve.Ndërsa e mbajnë sekret, ata humbasin gjithashtu mundësinë për ta bërë artikullin tuaj të shkëlqejë.Mos u bëj i zgjuar, duhet të jesh më i sinqertë se Zhang-u i vendit në kërkimin shkencor, nëse dëshiron të jesh i zgjuar, artikulli do të të bëjë budalla.

duhet të mbani mend numrin e produktit të kompletitkur porosisni kompletin dhe shkruani artikullin.Në përgjithësi ka dy numra në komplet: Cat—numri i katalogut (numri i produktit, numri i artikullit), Loti—numri i grupit të produktit ( Përdoret për të treguar se nga cila grup erdhi produkti).

Për më tepër, numri CAS përdoret shpesh kur porosisni reagentë biokimikë, dhe unë do ta popullarizoj atë së bashku.Numri CAS është numri i dhënë nga Shoqëria Amerikane Kimike për çdo ilaç të ri kimik.Në përgjithësi, tre numra janë të lidhur me një vizë.Numri CAS i Rushuit: 7732-18-5.Kimikatet shpesh kanë pseudonime të shumta, por numri CAS është unik.Kur porositni ilaçin, mund të kontrolloni së pari numrin e tij CAS.

Më afër shtëpisë, pse duhet t'i përshkruajmë qartë këto gjëra?Në fakt, është gjithashtu për të kontrolluar cilësinë e nxjerrjes së ARN-së.Përdorimi i instrumenteve dhe kompleteve do ta bëjë nxjerrjen e ARN-së më të qëndrueshme.Shkalla e nxjerrjes së laboratorëve të zakonshëm nuk është e madhe dhe mund të merret me komplete.

Detajet e trajtimit me DNase ose RNase
Çështja e rëndësishme e PCR sasiore fluoreshente është parandalimi i kontaminimit të ADN-së dhe mos eksperimentoni nëse ka kontaminim.Prandaj, është e domosdoshme të deklaroni procesin që keni përdorur për përpunimin e ADN-së, në mënyrë që të demonstroni se ADN-ja në procesin eksperimental është hequr plotësisht dhe plotësisht.paraqitur nga një diagram skematik.

Diagrami skematik i ARN dhe ADN
Në përgjithësi, metoda për heqjen e ADN-së është trajtimi i ARN-së me DNazë pas nxjerrjes.Megjithatë, këto janë metoda relativisht të vjetra.Kompletet komerciale të nxjerrjes së ARN-së kanë mundur të heqin ADN-në gjatë procesit të nxjerrjes pa shtuar DNase.Për shembull, një seri komplete nga Foregene.

shënim: Heqja e ADN-së gjatë nxjerrjes së ARN-së është një shpatë shumë e rrezikshme me dy tehe, e cila do të zgjasë kohën e funksionimit të nxjerrjes së ARN-së dhe do të rrisë rrezikun e degradimit të ARN-së.Në thelb, është një shkëmbim ndërmjet rendimentit të ARN-së dhe pastërtisë.

Përveç kësaj, sasia e DNase e shtuar në kolonën e adsorbimit të bazuar në silicë është shumë e vogël dhe DNase me cilësi të lartë duhet të përdoret për të arritur efektin.DNaza e paoptimizuar nuk mund të tretet shpejt dhe plotësisht.Ky është një test i nivelit teknik të tregtarit.Sigurisht, ka tregtarë edhe më të çuditshëm që mburren se ADN-ja mund të hiqet pa DNase.Mund të thuhet se kushdo që mburret se ADN-ja mund të hiqet plotësisht pa DNase është huligan.ADN-ja është një strukturë relativisht e qëndrueshme me dy fije, dhe nuk mund të fshihet vetëm duke folur dhe duke qeshur.

Vlerësimi i kontaminimit
metoda e vlerësimit: zbulimi i elektroforezës, 1% agarozë, 6V/cm, 15min, ngarkimi 1-3 ul

Analiza sasiore e acidit nukleik
zakonisht matet duke përdorur një spektrofotometër UV.Më lejoni së pari të popullarizoj kuptimin e tre vlerave të OD260, OD280 dhe OD230.
·OD260nm: Është gjatësia e valës së përthithjes së pikut më të lartë të përthithjes së acidit nukleik, dhe vlera e matur më e mirë varion nga 0.1 në 1.0.Nëse jo, holloni ose përqendroni kampionin për ta sjellë atë brenda rrezes.
·OD280nm: Është gjatësia e valës së përthithjes së pikut më të lartë të përthithjes së proteinave dhe substancave fenolike.
·OD230nm: Është gjatësia e valës së përthithjes së pikut më të lartë të përthithjes së karbohidrateve.

Më tej, le të flasim për rolin e secilit tregues.Për A260, mund të përdoret për të matur rendimentin e acidit nukleik.Kur OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, ARN=40μg/ml.

Për pastërtinë, duhet të shohim raportet që shohim zakonisht: OD260/280 dhe OD260/230.
·ADN e pastër: OD260/280 është afërsisht e barabartë me 1.8.Kur është më i madh se 1,9, tregon se ka ndotje me ARN, dhe kur është më pak se 1,6, tregon se ka ndotje me proteina dhe fenol.
·ARN e pastër: 1.7
·OD260/230: Pavarësisht nëse është ADN ose ARN, vlera e referencës është 2.5.Kur është më pak se 2.0, tregon se ka ndotje të sheqerit, kripës dhe lëndëve organike.

Integriteti i ARN-së

Është shumë e rëndësishme të matet integriteti i ARN-së.Në përgjithësi, është e nevojshme të bëhet një eksperiment xhel denatyrimi i ARN-së për të kontrolluar nëse ndriçimi midis ARN-së 28S dhe 18S është një marrëdhënie e dyfishtë.Kur shfaqet brezi i tretë 5S, kjo do të thotë se ARN-ja ka filluar të degradohet, përveç jovertebrorëve.

Të dhënat për vlerësimin e cilësisë së ARN-së: Përveç testeve të mësipërme, ekzistojnë edhe disa teste instrumentale më të avancuara për sa i përket integritetit të ARN-së, siç është testi i integritetit RQI i sistemit të elektroforezës automatike Experion, i cili mund të zbulojë nëse ARN është degraduar në mënyrë të padukshme.

Në kërkimin shkencor, PCR sasiore fluoreshente është një krahasim midis gjenit të synuar dhe gjenit të brendshëm të referencës.Prandaj, në procesin e ruajtjes së mostrës së ARN-së, nxjerrjes së ARN-së, etj., qëllimi kryesor është të sigurohet integriteti i ARN-së.

Se si integriteti i ARN-së ndikon në ekuilibrin midis gjenit të synuar dhe gjenit të brendshëm të referencës mund të kuptohet lehtësisht nga figura më poshtë.Degradimi do të çojë në paplotësinë e gjenit, pavarësisht nëse është paplotësia e gjenit të brendshëm referues apo paplotësia e gjenit të synuar, do të ketë një ndikim të madh në të dhënat.

Diagrami skematik i gjenit të synuar dhe gjenit referues, nuk duhet të jetë i vërtetë

Testi i frenimit (nëse vlera e CT është e shtypur në përqendrim të lartë ose të ulët ose kushte të tjera)

Duke marrë këtë figurë si shembull, vlerat Ct të pesë kthesave janë si më poshtë.Shpërndarja e vlerave të CT midis kurbave është e pabarabartë dhe vlerat e Ct vonohen në përqëndrime të larta dhe të ulëta, që është rasti i frenimit të PCR.

Pika kryesore: Në procesin e nxjerrjes së ARN-së, duhet të braktisim keqkuptimet dhe të vendosim ato të sakta.

Ideja e gabuar është: nxjerrja e ARN-së ndjek vetëm rendimentin, duke menduar se sa më e madhe të jetë sasia e ARN-së, aq më mirë.Në fakt, kur bëjmë kuantifikimin, nëse numri i gjeneve nuk është shumë i madh, nuk kemi nevojë për shumë ARN.Sasia e ARN-së që nxirrni është më se e mjaftueshme.

Koncepti i saktë është:Nxjerrja e ARN-së duhet të ndjekë pastërtinë, integritetin dhe qëndrueshmërinë.Pastërtia mund të sigurojë që transkriptimi i kundërt pasues të mos pengohet dhe të dhënat nuk do të ndikohen nga ADN-ja.Integriteti siguron ekuilibrin e sekuencave të synuara dhe referencave të brendshme.Konsistenca siguron ngarkim të qëndrueshëm të mostrës.

MIQE (4) – transkriptim i kundërt
Keqkuptim: ndjekja e volumit më të lartë të mostrës.
Koncepti i saktë: Ndiqni konsistencën (stabilitetin), pavarësisht nga sasia e ARN-së së ngarkuar, efikasiteti i transkriptimit të kundërt mbetet i qëndrueshëm, duke siguruar që ndryshimet në cDNA mund të pasqyrojnë vërtet ndryshimet në mRNA.
Ne e shpjegojmë këtë proces me një diagram skematik:

Diagrami skematik i efikasitetit të transkriptimit të kundërt, nuk është i vërtetë
Para së gjithash, ne duhet të kuptojmë ndryshimin midis procesit të transkriptimit të kundërt dhe procesit të PCR.PCR i nënshtrohet proceseve të shumta të ngrohjes dhe pjekjes, dhe fragmenti i synuar rritet në mënyrë eksponenciale;ndërsa transkriptimi i kundërt nuk e ka këtë proces, ne mund të imagjinojmë që transkriptimi i kundërt është në të vërtetë një-për-një Gjatë procesit të replikimit, po aq pjesë të ARN-së

pasi ka mund të marrë sa më shumë informacione të cDNA-së, duhet kuptuar tashmë, sepse fragmente të mëdha dhe të vogla janë transkriptuar kundërt dhe është e pamundur të fokusohesh në një fragment.Dhe për shkak se sasia e ARN-së është relativisht e vogël, sasia e cDNA e marrë është gjithashtu relativisht e vogël, ndryshe nga PCR, e cila ka një efekt përforcues, kështu që në thelb është e pamundur të zbulohet.

Rezultatet e elektroforezës së cADN-së
Së dyti, në mënyrë ideale, transkriptimi i kundërt kryhet një-për-një, por asnjë transkriptazë e kundërt nga asnjë kompani nuk mund ta arrijë këtë efekt.Në thelb, efikasiteti i shumicës së transkriptazave të kundërta endet midis 30-50%.Nëse është kështu, ne më mirë do të kishim një efikasitet relativisht të qëndrueshëm të transkriptimit të kundërt, që është ajo që duam të shohim në figurë: 3 ARN marrin 2 cDNA, 6 ARN marrin 4 cDNA, kështu që pavarësisht se sa mostra është ngarkuar, efikasiteti i transkriptimit të kundërt është relativisht i qëndrueshëm.Ne nuk duam të shohim situatën ku efikasiteti i transkriptimit të kundërt është i paqëndrueshëm dhe përqendrimi i lartë pengohet.

Pra, si të verifikohet nëse efikasiteti i transkriptimit të kundërt është i qëndrueshëm?Metoda është shumë e thjeshtë, ju duhet vetëm të bëni një test krahasimi: njëra është të bëni transkriptimin e kundërt në cDNA pas dyfishimit të hollimit të ARN-së, dhe tjetra është të bëni hollimin e dyfishtë pas transkriptimit të kundërt në cDNA, dhe më pas të bëni qPCR për të parë pjerrësinë e marrë A është konsistente.Si një student i mirë, ju duhet ta kuptoni atë në sekonda.Siç tregohet më poshtë:

Hollimi i ARN dhe cDNA për të testuar nëse efikasiteti i transkriptimit të kundërt është i qëndrueshëm
Transkriptaza e kundërt dhe kompleti
Si mundet PCR sasiore fluoreshente perfekte të ketë transkriptazë dhe komplet të shkëlqyer të kundërt.Transkriptaza e kundërt ndahet afërsisht në dy lloje sipas burimit, AMV oseM-MLV, dhe performanca e tyre është e njëjtë me atë të paraqitur në tabelë.

Aktiviteti i RNazës H
RNaza H është Ribonukleaza H, emri kinez është ribonukleaza H, e cila është një endoribonukleazë që mund të hidrolizojë në mënyrë specifike ARN-në në zinxhirin hibrid ADN-ARN.RNaza H nuk mund të hidrolizojë lidhjet fosfodiesterike në ADN ose ARN me një fije ose dy fije, domethënë nuk mund të tretet ADN ose ARN me një fije ose dy fije.Zakonisht përdoret në sintezën e vargut të dytë të cDNA.

Është një gjë e çuditshme.Themi se transkriptaza e kundërt ka aktivitet RNazë H, jo se transkriptaza e kundërt përmban RNazën H dhe mund të mos jetë e mundur të ndahet RNaza H nga transkriptaza e kundërt, ndoshta për shkak të konformimit të grupeve të caktuara në transkriptazën e kundërt Ky aktivitet shkaktohet nga transkriptaza e kundërt.

Prandaj, pavarësisht nga efikasiteti më i lartë i transkriptimit të kundërt të AMV, aktiviteti i saj RNase H redukton rendimentin e cDNA.Sigurisht, prodhuesit e reagentëve po optimizojnë vazhdimisht produktet e tyre për të eliminuar sa më shumë që të jetë e mundur aktivitetin e RNase H në transkriptazën e kundërt për të rritur rendimentin e cDNA.
Temperatura e pjekjes

Struktura dytësore e ARN në temperatura të ndryshme
Shihni figurën e mësipërme për strukturën dytësore të ARN-së në temperatura të ndryshme dhe përdorni mjetin online mFold për të përcaktuar strukturën dytësore të fragmentit të synuar në kushte specifike të temperaturës dhe përqendrimit të kripës.Në 55°C, struktura sekondare e ARN-së është ende shumë komplekse, transkriptaza e kundërt nuk mund të funksionojë dhe struktura sekondare nuk mund të zgjidhet plotësisht deri në 65°C, ndërsa temperatura optimale e AMV dhe M-MLV është shumë më e ulët se kjo temperaturë.
cfare te bejStruktura dytësore është çiftimi plotësues i vetë shabllonit, i cili çon në konkurrencë të fortë midis primerit dhe transkriptazës së kundërt dhe shabllonit, duke rezultuar në një sërë problemesh si E i ulët dhe përsëritshmëri e dobët.

cfare te bejVetëm rrisni temperaturën e pjekjes sa më shumë që të jetë e mundur.

Shumë prodhues të reagentëve po përmirësojnë transkriptazën e tyre të kundërt përmes inxhinierisë gjenetike.Disa rrisin temperaturën e reaksionit, si Jifan dhe Aidelai, dhe disa heqin grupin aktiv të enzimës RNase H për të përmirësuar afinitetin midis enzimës dhe shabllonit të ARN-së.Afiniteti i lartë mund të shtrydh në mënyrë konkurruese strukturën dytësore dhe të lexojë pa probleme, dhe gjithashtu të përmirësojë në masë të madhe efikasitetin e transkriptimit të kundërt.
Pika kryesore: Transkriptimi i kundërt është më i rëndësishëm për të ndjekur konsistencën e efikasitetit të transkriptimit të kundërt (enzimat duhet të jenë jo vetëm efikase, por edhe të qëndrueshme), sesa sasia e kampionit të ngarkuar, nëse nuk është një PCR sasiore fluoreshente veçanërisht në shkallë të gjerë, nuk do të jetë fare e mundur.cADN të shumta.
Prodhues të ndryshëm kanë bërë gjithashtu disa përpjekje në ndjekjen e qëndrueshmërisë.Për shembull, shumica e kompanive tani kanë paketuar transkriptimin e kundërt si një çantë standarde për shitje, që është një zgjedhje e mirë.
Për shembull, kompletet e serisë RT Easy të Foregene:

RT Easy I (Premiksi kryesor për kompletin e sintezës së cDNA të vargut të parë)

MIQE (5) – informacioni i gjenit të synuar

Figura e mësipërme shpjegon
1. Nëse ky gjen është efektiv për eksperimente të përsëritura, në përgjithësi mund të verifikohet nga eksperimente të përsëritura.
2. ID e gjenit, ju e dini.
3. Gjatësia e gjenit, gjatësia totale e gjenit të synuar është padyshim asnjë problem.Kur dizajnoni primerët, sigurohuni që gjatësia e amplikonit të jetë midis 80-200 bp për të siguruar një efikasitet më të mirë të amplifikimit.
4. Informacioni i krahasimit të sekuencës Blast, gjeni i synuar duhet të krahasohet në bankën e gjeneve për të parandaluar amplifikimin jospecifik.
5. Prania e pseudogjeneve.Një pseudogjen është një sekuencë e ADN-së e ngjashme me një gjen normal, por humbet funksionin e tij normal.Shpesh ekziston në familjen shumëgjenike të eukariotëve.Zakonisht përfaqësohet nga ψ.Është një kopje jofunksionale e ADN-së gjenomike në gjenom që është shumë e ngjashme me sekuencën e gjenit kodues., në përgjithësi nuk transkriptohen dhe nuk kanë kuptim të qartë fiziologjik.
6. Pozicioni i abetareve në raport me ekzonet dhe intronet.Në vitet e para, kur zgjidhëm problemin e kontaminimit të ADN-së, shpesh i kushtonim vëmendje pozicioneve të primerëve, ekzoneve dhe introneve dhe në përgjithësi konsideronim projektimin e abetareve nëpër introne për të shmangur amplifikimin e ADN-së.Ju lutemi shikoni figurën më poshtë: e zeza përfaqëson intronet, blutë e ndryshme përfaqësojnë ekzone, trëndafili përfaqëson primerët e zakonshëm dhe e kuqja e ndezur përfaqëson abetaret që përfshijnë introne.

Skematike, asnjëherë e vërtetë
Çfarë plani perfekt duket ky, por në fakt, në shumicën e rasteve, abetaret trans-intronike nuk janë aq magjike sa imagjinohet dhe do të shkaktojnë gjithashtu përforcim jo specifik.Pra, mënyra më e mirë për të parandaluar kontaminimin e ADN-së është heqja e plotë e ADN-së.
7. Parashikimi i konformacionit.Duke përdorur përsëri këtë shembull, përdorni mjetin online mFold për të përcaktuar strukturën dytësore të fragmentit të synuar në një temperaturë specifike dhe përqendrim kripe.

Struktura dytësore e ARN në temperatura të ndryshme
Struktura dytësore është çiftimi plotësues i vetë shabllonit, i cili do të çojë në një konkurrencë të fortë midis çiftimit të primerit dhe shabllonit, dhe shanset për lidhjen e primerit janë më të vogla, duke rezultuar në një sërë problemesh si E i ulët dhe përsëritshmëri e dobët.Përmes parashikimit të softuerit, nëse nuk ka problem të strukturës dytësore, do të ishte mirë.Nëse ka, artikulli ynë vijues do të diskutojë në mënyrë specifike se si të zgjidhet ky problem.

MIQE (6)-qPCR Oligonukleotide

Për PCR sasiore fluoreshente, gjëja e parë me të cilën luftoni çdo ditë është nxjerrja e ARN-së dhe gjëja e dytë mund të jetë dizajni i primerit.
Para së gjithash, ne ende kontrollojmë rregullat për dizajnin e primerit sipas listës së kontrollit MIQE.Është kaq e thjeshtë sa të qeshurit mund të qeshin, dhe ne mund ta përfundojmë me një fjali: zbuloni sekuencën dhe pozicionin e sondës së abetares dhe metodën e modifikimit.Për metodën e pastrimit të primerit, sinteza e primerit është kaq e lirë aktualisht, qPCR është e denjë për metodat e pastrimit PAGE dhe më lart, dhe informacioni i instrumentit të sintezës nuk është i rëndësishëm.Shumë njerëz kanë bërë abetare për dekada dhe nuk e dinë që sintetizuesi është ABI3900.
Për sa i përket parimeve të dizajnit të abetares, nuk keni pse t'i mësoni përmendësh, sepse shumica e softuerëve të projektimit të abetareve ose mjeteve online mund të kujdesen për këto probleme (rekomandohet mjeti online primer3.ut.ee/), dhe 99,999% e dizajnit të primerit nuk bëhet me dorë.
Vetëm kontrolloni pikat e mëposhtme pasi të jenë projektuar abetaret:
1. Projektimi i primerëve afër skajit 3': Në rastin e përdorimit të primerëve oligo dT për sintezën e vargut të parë të cDNA, duke marrë parasysh efikasitetin e transkriptimit të kundërt dhe integritetin e ARN-së, primerët e projektuar duhet të dizajnohen afër skajit 3' për të përmirësuar efikasitetin e amplifikimit.Përdorni një figurë për të shpjeguar si më poshtë (nuk ka asnjë mënyrë për ta kuptuar këtë):

Pse duhet të projektohen abetare afër fundit 3′, nuk duhet të jetë e vërtetë
2. Vlera TM: Vlera e Tm është në 55-65°C (sepse aktiviteti i ekzonukleazës është më i larti në 60°C), dhe përmbajtja GC është në 40%-60%.
3. BLAST: Për të shmangur amplifikimin jospecifik të gjenomit, Blast duhet të përdoret për verifikim shtesë.

MIQE (7) - proces qPCR

1. Kit qPCR
Sipas kërkesave të MIQE, duhet të përshkruajmë qartë kushtet e plota të reagimit në artikull, duke përfshirë konfigurimin e sistemit të reagimit PCR, çfarë komplete përdoret, kush është prodhuesi, sa i madh është sistemi i reagimit, nëse përdoret metoda e ngjyrosjes apo metoda e sondës, cilësimet e programit PCR.Drejtuesit veteranë do të zbulojnë patjetër se për sa kohë që kompleti është zgjedhur, informacioni i mësipërm është i përcaktuar në thelb.
Aktualisht, prodhimi dhe prodhimi i kompleteve sasiore fluoreshente PCR është një teknologji shumë e pjekur.Për sa kohë që nuk zgjidhni prodhues jashtëzakonisht të këqij, probabiliteti i problemeve nuk është i lartë, por ne ende duam të ndajmë me ju disa pika:
Enzima Taq me fillim të nxehtë:Pjesa më e rëndësishme e PCR është enzima Taq e fillimit të nxehtë.Enzimat e fillimit të nxehtë në treg përgjithësisht ndahen në dy lloje, njëra është një enzimë e ndezjes së nxehtë e modifikuar kimikisht (mund ta imagjinoni si futje parafine), dhe tjetra është një enzimë e ndezjes së nxehtë për modifikimin e antitrupave (lidhja antigjen-antitrup).Modifikimi kimik është një mënyrë e hershme e enzimave me fillim të nxehtë.Kur arrihet një temperaturë e caktuar, enzima do të çlirojë aktivitetin e saj.Enzima e fillimit të nxehtë të modifikuar nga antitrupat përdor metoda biologjike për të bllokuar aktivitetin e enzimës.Kur arrihet një temperaturë e caktuar, antitrupi do të denatyrohet dhe çaktivizohet si proteinë dhe aktiviteti i enzimës do të vihet në lojë.

Megjithatë, çfarë dobie ka kjo?Ky është rasti, aktiviteti i çlirimit të enzimave të modifikuara me antitrupa është më i shpejtë se ai i enzimave të modifikuara kimikisht, kështu që përsa i përket ndjeshmërisë, enzimat e modifikuara me antitrupa kanë një avantazh të vogël, kështu që në thelb nuk ka enzima të modifikuara kimikisht në komplet në treg.Nëse ka, atëherë teknologjia e këtij prodhuesi është ende e mbërthyer në epokën e mijëvjeçarit.
Përqendrimi i joneve të magnezit:Përqendrimi i joneve të magnezit është shumë i rëndësishëm në reagimin PCR.Përqendrimi i duhur i joneve të magnezit mund të nxisë lirimin e aktivitetit të enzimës Taq.Nëse përqendrimi është shumë i ulët, aktiviteti i enzimës do të reduktohet ndjeshëm;nëse përqendrimi është shumë i lartë, amplifikimi jo specifik i katalizuar nga enzima do të rritet.Përqendrimi i joneve të magnezit do të ndikojë gjithashtu në pjekjen e abetareve, temperaturën e shkrirjes së shabllonit dhe produkteve PCR, duke ndikuar kështu në rendimentin e fragmenteve të përforcuara.Përqendrimi i joneve të magnezit përgjithësisht kontrollohet në 25 mM.Sigurisht, për një komplet të mirë, përqendrimi i joneve të magnezit duhet të kontrollohet mirë.Disa tregtarë shtojnë një agjent kelues të joneve të magnezit në reagent, i cili mund të arrijë efektin e rregullimit automatik të përqendrimit të joneve të magnezit.
Përqendrimi i bojës fluoreshente:Ngjyra fluoreshente, e cila është jeshile SYBR që ne zakonisht përdorim, kryesisht gjeneron fluoreshencë duke u lidhur me brazdën e vogël të ADN-së me dy fije, sepse lidhja e ngjyrosjes së ADN-së me dy fije është jo specifike, domethënë do të thotë për sa kohë që ADN-ja me dy fije është e kombinuar me të, fluoreshenca mund të ndodhë, kështu që primer-dimers dhe ADN-të modelet në sistem do të kombinohen me të me të në një sinjal të sfondit.
PS: Për shkak të vetive të tij të ndjeshme ndaj dritës, produktet në treg përgjithësisht paketohen në tuba centrifugash të errët ngjyrë kafe (siç tregohet në foton më poshtë).Megjithatë, kjo do të hasë një problem.Është e vështirë të shihet nëse lëngu është thithur gjatë marrjes së mostrave.Në këtë drejtim, Qingke është me të vërtetë më miqësore për përdoruesit (siç tregohet në foton më poshtë), dhe tubi transparent është i paketuar në një qese kallaji të errët.Më pas vendoseni në një qese kallaji, duke marrë parasysh lehtësinë e shmangies së dritës dhe marrjen e mostrave.Ju duhet të zgjidhni numrin e duhur të produktit.TSE204 është një ekzistencë super ekonomike, e cila më bën të dëshiroj të mbjell bar.

Përqendrimi i bojës fluoreshente është gjithashtu shumë i rëndësishëm.Nëse përqendrimi është shumë i ulët, kurba e amplifikimit nuk do të rritet në fazën e mëvonshme dhe nuk është e përsosur;nëse përqendrimi është shumë i lartë, do të shkaktojë ndërhyrje në zhurmë.Meqenëse PCR sasiore fluoreshente varet kryesisht nga vlera e CT, nëse përqendrimi i ngjyrës fluoreshente nuk rregullohet siç duhet, pika e ulët është më e mirë se pika e lartë.Sigurisht, përqendrimi i duhur i bojës është më i miri.

ROX: Bojrat ROX përdoren për të korrigjuar gabimet e sinjalit të fluoreshencës nga pusi.Disa prodhues të instrumenteve kërkojnë kalibrim, ndërsa të tjerët jo.Për shembull, përdorimi i instrumentit të amplifikimit PCR në kohë reale të Thermo Fisher Scientific zakonisht kërkon kalibrim, duke përfshirë 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, etj. Udhëzimet e përgjithshme të kompletit do ta përshkruajnë atë.
Përzierja qPCR e Foregene përmban gjithashtu bojë ROX, e cila është e përshtatshme për t'u përdorur në modele të ndryshme.

Kit-Taqman PCR në kohë reale

Trajtimi i lidhjes së dobët të hidrogjenit: Trajtimi i lidhjeve të dobëta hidrogjenore është një çështje relativisht teknike.Asgjë nuk i ka lexuar manualet e shumë kompleteve, por asnjëri prej tyre nuk e përmendi këtë temë.Në fakt, është kaq e rëndësishme.Kombinimi i bazave varet kryesisht nga forca e lidhjeve hidrogjenore.Lidhjet e forta hidrogjenore janë përforcim normal, dhe lidhjet e dobëta hidrogjenore çojnë në amplifikimin jo specifik.Nëse lidhjet e dobëta hidrogjenore nuk mund të eliminohen mirë, nuk mund të shmanget përforcimi jospecifik.Brenda fushëveprimit të autorit, vetëm disa kompani e kanë vënë re këtë problem.Kur blini kompletin, mund t'i referoheni nëse keni menduar një zgjidhje në këtë drejtim për kompletin që dëshironi të zgjidhni.

Vëllimi i reagimit: Sistemi 20-50ul përdoret më shpesh dhe vëllimet më të vogla ka të ngjarë të shkaktojnë gabime.Në përgjithësi, udhëzimet e kompletit do të rekomandojnë përdorimin e vëllimeve të reagimit PCR.Mos jini të zgjuar dhe përdorni vëllime më të vogla për të kursyer kostot.qëllimi i.Vëllimi i rekomanduar nga tregtarët në fakt është testuar dhe mund të ndodhë që ata nuk mund të zgjidhin problemin e gabimeve të shkaktuara nga vëllimet e vogla.
2. Numri i prodhuesit dhe artikullit të pllakës së tubit
Të gjithë e dinë parimin e PCR sasiore fluoreshente.Mbledhja e fluoreshencës kryhet kryesisht përmes kapakëve të tubave PCR.Kur zgjidhni materiale harxhuese PCR, kushtojini vëmendje dy pikave: transmetimi i mirë i dritës dhe i përshtatshëm për instrumentin.Në përgjithësi, bordet dhe tubat e markave kryesore janë të mira, por duhet të zgjidhni me kujdes përsa i përket përshtatjes, përndryshe nuk do të mund ta përdorni instrumentin.

4. Njohuri të nivelit të lartë

MIQE (8) - vërtetimi qPCR
Ky është prioriteti kryesor i qPCR!Kaq shumë heronj kanë rënë në rërë këtu.Sigurisht, është gjithashtu e mundur që të jeni me fat dhe gjenet që keni studiuar janë të thjeshta, kështu që keni lundruar nëpër shpellën e akullit përgjatë erës.Informacioni i verifikimit të qPCR synon të testojë besueshmërinë e të dhënave.Ne listojmë informacionin e nevojshëm të verifikimit si më poshtë:

1.Testi i specifikës
Specifikimi i amplifikimit të gjenit të synuar testohet duke kontrolluar nëse fotografia e elektroforezës është një brez i vetëm;verifikimi i renditjes;kurba e shkrirjes për të parë nëse harta e pikut është e vetme;verifikimi i tretjes së enzimave dhe metoda të tjera.
Këtu, ne fokusohemi në tanaliza e amplifikimit jospecifik duke përdorur metodën e kurbave të shkrirjes.Në përgjithësi, kur projektojmë abetare, madhësia e fragmentit të produktit kërkohet të jetë në intervalin 80-200 bp, gjë që e bën temperaturën e shkrirjes së produktit PCR 80-85 °C.Prandaj, nëse ka maja të ndryshme, duhet të ketë produkte të tjera amplifikuese jo specifike;nëse kulmi shfaqet nën 80°C, në përgjithësi konsiderohet të jetë një dimer primer;nëse kulmi shfaqet mbi 85°C, përgjithësisht konsiderohet si kontaminim i ADN-së ose më shumë përforcim jospecifik i fragmenteve të mëdha.
Shënim: Ndonjëherë ka vetëm një kulm të vetëm në 80°C.Në këtë kohë, ky koncept duhet t'i përmbahet.Ka të ngjarë që rezultatet e amplifikimit të jenë të gjithë dimerë primer.

Kurba normale e shkrirjes (pika e vetme pa përforcim jospecifik)

Kurba problematike e shkrirjes (përforcim jo specifik i majave të rreme)
【Analiza e rastit】

Ka një kulm kryesor, por dimeri i primerit është serioz
Kurba e shkrirjes me një majë të vetme në figurën e mëposhtme mund t'ju mashtrojë lehtësisht sytë, duke menduar se është një eksperiment i përsosur, por rezultati është krejtësisht i gabuar.Në këtë kohë, ne duhet të shikojmë temperaturën e shkrirjes.Temperatura maksimale është nën 80°C, e cila është plotësisht primer-dimer.

Asnjë fragment i synuar, të gjithë dimerët e primerit
Këtu, vëllai im nuk mund të ndalet.Fotoja më poshtë është një foto e bërë me një celular që më dërgoi një pleh.Reagentët që ai përdori janë të gjithë marka të përdorura në industri.Ai ndryshoi nga një markë e prefiksit T në një markë tjetër të prefiksit T.Unë mendoj se ju tashmë e keni marrë me mend.Plehra më qau: “Reagenti i përdorur në foton e parë është shumë i mirë, dhe kulmi është i vetëm.Më vonë, pasi përdorni reagentin që ju rekomanduat, ai bëhet si në foton e dytë, me maja të përziera.Më ke bërë të mjerë."
Ndani dy grafikët.Në pamje të parë, njëra ka një majë të vetme, dhe tjetra ka një majë të dyfishtë.E pakuptimta, një kulm i vetëm është sigurisht i mirë.A eshte e vertete?
Më keq se Dou E, po të vendos dy fotot në foton më poshtë, do ta kuptoni menjëherë.Në fakt, ne paralizohemi lehtësisht nga kjo lloj tabloje.Pas analizave të kujdesshme, zbuluam se: kulmi i figurës së parë është në 75°C, që është plotësisht dimer primer;kulmi i figurës së dytë shfaqet në 75°C dhe 82°C, të paktën ka Produkti shfaqet.

Foto të komenteve nga studentët
Pra, problemi themelor nuk është problemi i reagentëve, por problemi i dizajnit të primerit.Në të njëjtën kohë, dëshmon edhe se disa marka të mëdha nuk janë të cilësisë së hekurit dhe vërteton edhe atë që tha vëllai im më parë: Nuk është marka e reagentit që mbështet artikullin tuaj.Është artikulli juaj që ka mbështetur markën e reagentëve.Vetëm imagjinoni, nëse i poshtër nuk do të ndryshonte reagentët, të dhënat e gabuara do të dërgoheshin në ditar dhe ajo që do të ndodhte do të ishte një tragjedi.
2. Vlera Ct e kontrollit bosh
Mos e shpjegoni, nëse kontrolli bosh ka një vlerë Ct, a nuk është ndotje?Megjithatë, ju ende duhet të kuptoni se cili kontroll bosh ka një vlerë Ct.Nëse është NTC, do të thotë se ka ADN të huaj siç është kontaminimi me reagent.Nëse është NRT, do të thotë se ARN-ja e nxjerrë ka kontaminim të ADN-së.
3. Kurba standarde
Duke përfshirë pjerrësinë dhe formulën e llogaritjes, efikasiteti i PCR mund të llogaritet përmes formulës.Një eksperiment i përsosur kërkon që pjerrësia e kurbës standarde t'i afrohet 3,32 dhe R² të afrohet 0,9999.
4. Gama dinamike lineare
Gama dinamike e reaksionit është lineare.Sipas shabllonit të përdorur për të gjeneruar lakoren standarde, diapazoni dinamik duhet të përfshijë të paktën 5 gradientë përqendrimi dhe t'i kushtojë vëmendje ndryshimit të vlerave të Ct në gradientët e përqendrimit të lartë dhe gradientët e përqendrimit të ulët.
5. Saktësia e zbulimit
Ndryshimet në rezultatet e qPCR, domethënë përsëritshmëria e dobët, domethënë saktësia e dobët, shkaktohen nga shumë faktorë, duke përfshirë temperaturën, përqendrimin dhe funksionimin.Precisioni qPCR në përgjithësi bëhet më pak i kontrollueshëm ndërsa numri i kopjeve zvogëlohet.Në mënyrë ideale brenda variacionit eksperimental, ky variacion teknik duhet të jetë i dallueshëm nga variacioni biologjik dhe replikat biologjike mund të adresojnë drejtpërdrejt ndryshimet statistikore në rezultatet qPCR midis grupeve ose trajtimeve.Në veçanti për analizat diagnostike, duhet të raportohet saktësia më e mirë ndërmjet analizave (përsëritshmëria) në vende dhe operatorë.
6. Efikasiteti i zbulimit dhe LOD (në qPCR multipleks)
LOD është përqendrimi më i ulët prej 95% të mostrave pozitive të zbuluara.Me fjalë të tjera, përqendrimi i LOD që përmbahet brenda një grupi të replikimeve të gjenit të synuar nuk duhet të kalojë 5% të reaksioneve të dështuara.Kur bëni analizë multiplex qPCR, veçanërisht për zbulimin e njëkohshëm të mutacioneve pika ose polimorfizmave, multiplex qPCR duhet të ofrojë prova që saktësia e fragmenteve të shumëfishta të objektivit nuk rrezikohet në të njëjtin tub, zbulimi i shumëfishtë dhe zbulimi i një tubi të vetëm Efikasiteti dhe LOD duhet të jenë të njëjta.Sidomos kur gjenet e synuara me përqendrim të lartë dhe gjenet e synuara me përqendrim të ulët amplifikohen njëkohësisht, këtij problemi duhet t'i kushtohet vëmendje.
Problemet dhe zgjidhjetNë përgjithësi, problemet që hasen shpesh në korrigjimin e qPCR fokusohen në aspektet e mëposhtme:
·përforcim jospecifik
·Zgjedhja e vështirë e përqendrimit të primerit dhe problemi me primer-dimerët
·Temperatura e pjekjes është e pasaktë
·Struktura dytësore ndikon në efikasitetin e amplifikimit
amplifikimi jospecifik
amplifikim jo specifikndodh , përgjithësisht konsiderohet nëse dizajni i primerit nuk është i përshtatshëm, por nëse nuk jeni me nxitim për të ndryshuar abetare, mund të provoni fillimisht metodat e mëposhtme (parimi është gjithashtu i bashkangjitur):
·Rrisni temperaturën e pjekjes – përpiquni të krijoni lidhje të dobëta hidrogjeni të paaftë për të ruajtur;
· Shkurtoni kohën e pjekjes dhe zgjatjes - zvogëloni mundësinë e lidhjeve të dobëta hidrogjenore;
·Zvogëloni përqendrimin e primerit – zvogëloni mundësinë e lidhjes së primerëve të tepërt dhe rajoneve jo të synuara;
Efikasitet i ulët i amplifikimit
Situata e kundërt me amplifikimin jospecifik - efikasiteti i ulët i amplifikimit dhe masat për t'u marrë me efikasitetin e ulët të amplifikimit janë pikërisht e kundërta:
·Zgjatni kohën e pjekjes dhe zgjatjes;
· Ndryshoni në PCR me tre hapa dhe zvogëloni temperaturën e pjekjes;
·Rritja e përqendrimit të primerit;
Ps: Shumë studentë të diplomuar të lindur në vitet '90 nuk janë të gatshëm të studiojnë se si të korrigjojnë eksperimentet dhe shpresojnë që kompleti mund ta zgjidhë plotësisht problemin (nëse doni të shkoni në një kompani reagjente për të bërë kërkime dhe zhvillim pas diplomimit), në fakt, edhe prodhuesit e reagentëve mendojnë në këtë mënyrë, shpresoj se është një budalla. Mund të përdoret kur e merrni atë, kështu që një problem i madh i reagentëve, duke përfshirë këtu edhe përpjekjet e prodhuesve, kanë për të zgjidhur një problem jo-specifik të prodhuesve. faktorë të dobët të përthithjes së lidhjes H.Për të zgjidhur lehtësisht problemin, budallenjtë duhet ende të lexojnë prezantimin e kompanisë së reagentëve për të parë nëse ekziston një faktor që thith lidhjet e dobëta të hidrogjenit.
Zgjedhja e vështirë e përqendrimit të primerit dhe probleme me primer-dimerët
Metoda 1: Në përgjithësi, udhëzimet e kompletit për qPCR kanë sisteme të rekomanduara dhe përqëndrime të rekomanduara të primerit.
Metoda 2: Korrigjimi duke vendosur gradientin e përqendrimit të primerit.Fotografia e mëposhtme është vjedhur nga një kompani për ta ilustruar.Figura më poshtë tregon rezultatet sasiore të fluoreshencës të bëra me tre gradientë të përqendrimit të primerit (100nM, 250nM, 500nM) dhe katër gradientë të përqendrimit të shabllonit (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Vlera Ct e rezultateve eksperimentale paraqitet si më poshtë:

Përzgjedhja e përqendrimit të abetares Lidhni çdo përqendrim të abetares në një vijë si më poshtë:

Zgjedhja e përqendrimit të primerit është e qartë, lidhja lineare e përqendrimit të primerit prej 100nM dhe 250nM është më e mirë, dhe marrëdhënia lineare e përqendrimit të primerit prej 500nM është relativisht e dobët.Në 100nM dhe 250nM, vlera e Ct prej 250nM është relativisht e vogël, kështu që përqendrimi optimal i primerit është 250nM.Në kurbën e shkrirjes mund të shihen përgjithësisht dimerë-primer të rëndë.Po sikur abetaret e projektuara nuk mund t'i shmangin primer-dimerët?
Metoda 3: Zvogëloni sasinë e abetareve dhe rrisni temperaturën e pjekjes (nuk ka nevojë për shpjegim).
Vlera empirike e temperaturës së pjekjes është 60°C.Nëse nuk jeni të sigurt, si të zgjidhni një temperaturë më të përshtatshme pjekjeje?Përgjigja është e njëjtë me zgjedhjen e përqendrimit të abetares -test gradient.Bëni një fotografi nga kompania Bio-rad për të ilustruar problemin.Për amplifikimin e një fragmenti të caktuar të synuar, vendosni tetë gradientë të temperaturës, secili me tre përsëritje, dhe kurba e amplifikimit të marrë është si më poshtë:

Zgjedhja e temperaturës së pjekjes:
·70°C, 69°C—Në thelb, primerët nuk mund të kombinohen, kështu që nuk ka përforcim.
·67.3°C – Ka një sasi të vogël amplifikimi në fillim dhe vlera Ct është relativisht e madhe.
·64,5°C——Vlera Ct zvogëlohet.
·Në 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C dhe 55.0°C, vlerat e Ct në thelb prireshin të ishin të qëndrueshme, por vlerat përfundimtare të fluoreshencës ishin të ndryshme.
Si të zgjidhni?Parimi: Parimi i parë është vlera më e lartë Ct.Për të njëjtën vlerë Ct, zgjidhni një temperaturë më të lartë pjekjeje për të shmangur dimerizimin dhe amplifikimin jospecifik.Megjithëse ka një vlerë më të lartë fluoreshence në 55°C, mund të ketë dimerë ose përforcim jospecifik në të.
Por nëse jeni aq i zgjuar sa ju, patjetër që do të mendoni: Në mënyrë logjike, nëse reagimi PCR është shumë specifik, për sa kohë që përqendrimi i primerit tejkalon kërkesën minimale, pikat e larta dhe të ulëta nuk duhet të kenë asnjë efekt, ashtu si ngjyrat fluoreshente dhe dNTP-të.Në të vërtetë, për sa kohë që temperatura e pjekjes optimizohet siç duhet, efekti i përqendrimit të primerit në vlerën e Ct natyrisht do të minimizohet.

Temperatura e pjekjes është optimizuar siç duhet dhe efekti i përqendrimit të primerit në CT do të minimizohet
Struktura dytësore ndikon në efikasitetin e amplifikimit
Le të marrim foton nga Bio-rad për të ilustruar problemin.Ai gjithashtu harton një gradient të temperaturës për të amplifikuar një gjen me një strukturë dytësore.

Shfaqet struktura dytësore
Mund të shihet se me zvogëlimin e gradientit të temperaturës, produktet fillojnë të shfaqen dhe vlera Ct lëviz përpara, duke arritur vlerën minimale në 60.7°C, dhe më pas me zvogëlimin e gradientit të temperaturës, vlera Ct bëhet më e madhe.Në të kundërt, me rritjen e temperaturës, struktura sekondare hapet dhe efikasiteti i amplifikimit rritet.Pas arritjes së një temperature të caktuar, rritja e temperaturës nuk mund të përmirësojë efikasitetin e amplifikimit.Sepse abetaret nuk mund të kombinohen në mënyrë të qëndrueshme në këtë kohë.Prandaj,kërkoni temperaturën me vlerën më të ulët të Ct, cila është temperatura më e mirë për përforcimin e shabllonit të strukturës dytësore!Sigurisht, budallenjtë e zgjuar duhet të dinë se nëse nuk është e nevojshme, është mirë të ndërrohen abetaret dhe të shmanget rajoni i strukturës dytësore.
5. Niveli i aplikimit
MIQE-Analiza e të dhënave

Analiza e të dhënave jepet kryesisht nga instrumenti sasior PCR fluoreshente.Në artikullin e mëparshëm është bërë shumë punë për analizën e të dhënave, siç është kontrolli bosh, i cili është shpjeguar në hartimin e eksperimentit.Janë sqaruar gjenet e brendshme të referencës, numrat e përsëritur etj., këtu kryesisht shpjegojmë aplikimin e qPCR.
qPCR përdoret gjerësisht dhe verifikimi eksperimental dhe diagnoza e acidit nukleik janë skenarët më të përdorur.
kuantifikimi absolut
Log (përqendrimi fillestar) ka një lidhje lineare me numrin e cikleve.Një kurbë standarde mund të nxirret nga një standard me numër të njohur të kopjes fillestare, domethënë mund të merret marrëdhënia lineare e reaksionit të amplifikimit.Sipas vlerës Ct të kampionit, përqendrimi në kampion mund të llogaritet.Sasia e shablloneve që duhen përfshirë.

Metoda e llogaritjes sasiore absolute
Kuantifikimi absolut duhet të bazohet në kurbën standarde.Për të bërë një kurbë standarde, kërkohet një standard.Zakonisht, standardi është një plazmid i marrë nga klonimi i gjenit të synuar.Pse është një plazmid?Sepse ADN plazmidike rrethore është më e qëndrueshme.Holloni produktin standard në 5 deri në 6 gradientë sipas raportit të dyfishimit (hollimi 10-fish) dhe kushtojini vëmendje uniformitetit gjatë hollimit.Lëreni vlerën Ct të bjerë midis 15-30.

Përgatitja standarde
Në të njëjtën kohë, kampioni që do të testohet duhet gjithashtu të hollohet në përputhje me rrethanat (kujtoni faktorin e hollimit) dhe vlera Ct gjithashtu duhet të bjerë midis 15-30.Produkti standard + mostra që do të testohet vendosen së bashku në makinë.Pas kalimit, u bë një kurbë standarde me substancën standarde dhe mostrat që do të testoheshin u futën në kurbën standarde për të llogaritur përqendrimin.
Kuantifikimi i virusit të hepatitit B HBV është një kuantifikimi tipik absolut, i cili mund të llogarisë numrin e kopjes së virusit në 1 ml gjak.
Llogaritja e numrit të kopjes
Përqendrimi i kampionit që do të testohet (ng/ul) = OD260 × 50 ug/ml × faktori i hollimit
Pesha molekulare e mostrës = numri i bazave × 324
Numri i kopjes së mostrës që do të testohet (kopje/ul) = përqendrimi i kampionit që do të testohet / pesha molekulare e kampionit × 6 × 1014

Mënyra e llogaritjes së numrit të kopjes

Më sipër është metoda e llogaritjes për përcaktimin e sasisë.Ky është një problem matematikor që mund të zgjidhet pas mbarimit të shkollës së mesme dhe problemet matematikore përgjithësisht zgjidhen me kompjuter.Nëse nuk e kuptoni, mund të vini të komunikoni.
kuantifikimi relativ
Kuantifikimi relativ përdoret kryesisht në kërkimin shkencor.Sa viruse ka në 1 ml gjak, dhe është një virus i ADN-së, kjo është një ngjarje relativisht deterministe: sasia e gjakut mund të përcaktohet dhe virusi i ADN-së është relativisht i qëndrueshëm.Sidoqoftë, është e vështirë për ne të krahasojmë numrin e kopjeve të transkriptimit të një gjeni të caktuar në një gjethe, sepse është e vështirë të përcaktohet madhësia, pesha dhe butësia e gjethes, sasia e ARN-së së nxjerrë është e vështirë të përcaktohet dhe efikasiteti i transkriptimit të kundërt është gjithashtu i vështirë për t'u përcaktuar, domethënë, asnjë hap mund të bëjë që të dhënat eksperimentale të mos kenë gabime dhe të përdoren.
Prandaj, kuantifikimi relativ duhet të prezantojë një element:gjeni i brendshëm i referencës.
Me fjalë të tjera, kuantifikimi relativ është në fakt një krahasim midis gjenit të synuar dhe gjenit të brendshëm të referencës.Krahasuar në të njëjtin ind dhe të njëjtën qelizë, ndikimi i madhësisë së mostrës, sasisë së nxjerrjes së ARN-së, efikasitetit të transkriptimit të kundërt dhe efikasitetit të PCR është relativisht i vogël.Për shkak të madhësisë së vogël të kampionit, si gjenet e brendshme të referencës ashtu edhe gjenet e synuara u reduktuan relativisht.Kjo është arsyeja pse ne e kemi theksuar më parë uniformitetin dhe stabilitetin.
Gjenet e brendshme të referencës janë përgjithësishtgjenet e shtëpisë(gjenet shtëpiake), të cilat i referohen një klase gjenesh që shprehen në mënyrë të qëndrueshme në të gjitha qelizat dhe produktet e tyre janë të nevojshme për të ruajtur aktivitetet themelore jetësore të qelizave.
Mos e ngatërroni këtë koncept.Gjenet e shtëpisë janë terma të funksionit biologjik, ndërsa gjenet e referencës së brendshme janë terma teknikë eksperimentalë.Gjenet e shtëpisë duhet të kalojnë vërtetimin përpara se të mund të zgjidhen si gjene referencë të brendshme.
Për shembull, ne zgjodhëm disa gjene shtëpiake në figurën më poshtë për të testuar nivelet e tyre të shprehjes në qeliza të ndryshme të indeve dhe zbuluam se nivelet e shprehjes së β-2-mikroglobulinës ishin mjaft të ndryshme nga ato të tre gjeneve të tjera, kështu që ato nuk mund të përdoren si gjene referimi të brendshëm.

Pas kuptimit të funksionit të korrigjimit të gjenit të brendshëm të referencës, përftohen dy algoritme për shkak të futjes së gjenit të brendshëm të referencës.
· Metoda e kurbës së dyfishtë standarde
·2 – △△ Metoda Ct (metoda e krahasimit të vlerës CT)
Nëse jeni të interesuar të studioni speciet dhe funksionet e gjeneve, ju lutemi hiqni dorë nga kërkimi mbi algoritmet dhe përdorni formulat drejtpërdrejt, ose përdorni makinat drejtpërdrejt;nëse jeni njeri i drejtë në matematikë dhe inxhinieri, ju lutem mos ngurroni.
metoda e kurbës me standard të dyfishtë
Përcaktoni sasinë e gjenit të synuar dhe gjenit të ruajtjes së shtëpisë së kampionit të kontrollit dhe kampionit që do të testohet përmes kurbës standarde dhe më pas llogaritni vlerën relative sipas formulës së llogaritjes, e cila është niveli relativ i shprehjes.
Përparësitë: analizë e thjeshtë, optimizim eksperimental relativisht i thjeshtë
Disavantazhi: Për çdo gjen, çdo raund eksperimentesh duhet të bëjë një kurbë standarde
Zbatimi: Një nga dy metodat sasiore relative më të përdorura dhe më të njohura në studimin e rregullimit të shprehjes së gjeneve
Formula është si më poshtë:

Shembujt janë si më poshtë:

Llogaritni shumën relative bazuar në rezultatin sasior
2 – Metoda △△Ct (metoda e krahasimit të vlerës së CT)

Përparësitë: Nuk ka nevojë të bëni një kurbë standarde
Disavantazhet: Supozohet se efikasiteti i amplifikimit është afër 100%;devijimi standard është < 5%, dhe kurba standarde dhe efikasiteti ndërmjet çdo amplifikimi supozohen të jenë konsistente;optimizimi i kushteve eksperimentale është më i ndërlikuar.
Zbatimi: Një nga dy metodat sasiore relative më të përdorura dhe më të njohura në studimin e rregullimit të shprehjes së gjeneve

Natyrisht, efikasiteti i amplifikimit zakonisht është i pamundur të jetë në mënyrë perfekte 1. Metoda e korrigjimit: Nëse dimë që gjeni i synuar dhe gjeni i referencës kanë të njëjtin efikasitet amplifikimi, por efikasiteti i amplifikimit nuk është i barabartë me 1, atëherë 2-△△Ct mund të korrigjohet si: (1+E ) . , atëherë formula e llogaritjes mund të korrigjohet në 1,95-△△Ct
Deri më tani, përmbajtja rreth PCR sasiore fluoreshente ka marrë fund.